የደም ሞኖኑክሌር ህዋሶች (PBMCs) ብዙውን ጊዜ የሚሠሩት ከሙሉ ደም በ density gradient centrifugation ነው።እነዚያ ሴሎች ሊምፎይተስ (ቲ ሴሎች፣ ቢ ሴሎች፣ ኤንኬ ሴሎች) እና ሞኖይተስ ያቀፉ ናቸው፣ በ immunology መስክ፣ የሕዋስ ሕክምና፣ ተላላፊ በሽታ እና የክትባት ልማት።የPBMC አዋጭነት እና ትኩረትን መከታተል እና መተንተን ለክሊኒካዊ ላቦራቶሪዎች፣ ለመሰረታዊ የህክምና ሳይንስ ምርምር እና የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ምርት ወሳኝ ነው።
ምስል 1. የተለየ PBMC ከትኩስ ደም ከ Density gradient centrifugation ጋር
AOPI Dual-fluoresces ቆጠራ የሕዋስ ትኩረትን እና አዋጭነትን ለመለየት የሚያገለግል የምርመራ ዓይነት ነው።መፍትሄው የአክሪዲን ብርቱካን (አረንጓዴ-ፍሎረሰንት ኑክሊክ አሲድ ነጠብጣብ) እና ፕሮፒዲየም አዮዳይድ (ቀይ-ፍሎረሰንት ኑክሊክ አሲድ ነጠብጣብ) ጥምረት ነው.ፕሮፒዲየም አዮዳይድ (PI) የሜምብ ማግለል ቀለም ሲሆን ወደ ሴሎች ውስጥ የሚገቡት የተበላሹ ሽፋኖች ብቻ ሲሆኑ አሲሪዲን ብርቱካን ግን በአንድ ህዝብ ውስጥ ያሉትን ሁሉንም ሴሎች ውስጥ ዘልቆ መግባት ይችላል.ሁለቱም ማቅለሚያዎች በኒውክሊየስ ውስጥ በሚገኙበት ጊዜ, ፕሮፒዲየም አዮዳይድ የ acridine ብርቱካናማ ፍሎረሰንት በፍሎረሰንት ሬዞናንስ ኢነርጂ ማስተላለፊያ (FRET) እንዲቀንስ ያደርጋል.በውጤቱም፣ ያልተነካ ሽፋን ያላቸው ኒዩክሌድ ሴሎች የፍሎረሰንት አረንጓዴ ቀለም ይለብሳሉ እና እንደ ህያው ይቆጠራሉ፣ ነገር ግን ኑክሌር የተበላሹ ህዋሶች የፍሎረሰንት ቀይ ቀለም ያበላሻሉ እና የ Countstar® FL ስርዓትን ሲጠቀሙ እንደ ሙት ይቆጠራሉ።እንደ ቀይ የደም ሴሎች፣ ፕሌትሌቶች እና ፍርስራሾች ያሉ ኒውክሌድ ያልሆኑ ነገሮች ፍሎረሰስ አይሆኑም እና በCountstar® FL ሶፍትዌር ችላ ይባላሉ።
የሙከራ ሂደት፡-
1.የ PBMC ናሙናን ወደ 5 የተለያዩ ውህዶች ከፒቢኤስ ጋር ይቀንሱ;
2.12µl AO/PI መፍትሄ ወደ 12µl ናሙና አክል፣ በቀስታ ከ pipette ጋር ተቀላቅሏል።
3.20µl ቅልቅል ወደ ክፍል ስላይድ ይሳሉ;
4.ሴሎች በክፍሉ ውስጥ ለ 1 ደቂቃ ያህል እንዲቀመጡ ይፍቀዱ;
ወደ Countstar FL መሣሪያ 5.Insect ስላይድ;
6.የ"AO/PI Viability" ምዘና ምረጥ፣ በመቀጠል በ Countstar FL ሞክር።
ጥንቃቄ፡ AO እና PI እምቅ ካርሲኖጅንን ናቸው።ከቆዳ እና ከዓይኖች ጋር በቀጥታ እንዳይገናኙ ኦፕሬተሩ የግል መከላከያ መሳሪያዎችን (PPE) እንዲለብስ ይመከራል.
ውጤት፡
1.Bright Field እና Fluorescence ምስሎች የ PBMC
የ AO እና PI ቀለም ሁለቱም በሴሎች ሴል ኒውክሊየስ ውስጥ ዲ ኤን ኤ ያበላሻሉ.ስለዚህ፣ ፕሌትሌቶች፣ ቀይ የደም ሴሎች፣ ወይም ሴሉላር ፍርስራሾች የPBMCs ትኩረትን እና አዋጭነትን ሊነኩ አይችሉም።በ Countstar FL (ስእል 1) በተፈጠሩት ምስሎች መሰረት ህይወት ያላቸው ሴሎች፣ የሞቱ ሴሎች እና ፍርስራሾች በቀላሉ ሊለዩ ይችላሉ።
ምስል 2 የPBMC ብሩህ የመስክ እና የፍሎረሰንት ምስሎች
2.የፒቢኤምሲ ማጎሪያ እና አዋጭነት
የPBMC ናሙናዎች በ 2፣ 4፣ 8 እና 16 ጊዜ በPBS ተበርዘዋል፣ ከዚያም እነዚያ ናሙናዎች በAO/PI ማቅለሚያ ቅልቅል ተተክለው በ Countstar FL በቅደም ተከተል ተተነዋል።የ PBMC ትኩረት እና አዋጭነት ውጤት ከዚህ በታች ባለው ምስል ይታያል
