Periferik qan mononükleer hüceyrələri (PBMCs) tez-tez sıxlıq qradiyenti sentrifuqasiyası ilə tam qandan ayrılmaq üçün işlənir.Bu hüceyrələr limfositlərdən (T hüceyrələri, B hüceyrələri, NK hüceyrələri) və monositlərdən ibarətdir ki, bunlar immunologiya, hüceyrə terapiyası, yoluxucu xəstəliklər və peyvəndlərin inkişafı sahəsində geniş istifadə olunur.PBMC-nin canlılığının və konsentrasiyasının monitorinqi və təhlili klinik laboratoriyalar, əsas tibb elmi tədqiqatları və immun hüceyrə istehsalı üçün çox vacibdir.
Şək 1. Sıxlıq qradiyenti sentrifuqa ilə təzə qandan təcrid olunmuş PBMC
AOPI Dual-fluoresces hesablanması hüceyrə konsentrasiyasını və canlılığını aşkar etmək üçün istifadə edilən analiz növüdür.Həll akridin narıncı (yaşıl-flüoresan nuklein turşusu ləkəsi) və propidium yodidin (qırmızı-flüoresan nuklein turşusu ləkəsi) birləşməsidir.Propidium iyodid (PI) yalnız membranları zədələnmiş hüceyrələrə daxil olan bir membran xaric edən boyadır, akridin narıncı isə populyasiyanın bütün hüceyrələrinə nüfuz edə bilir.Hər iki boya nüvədə olduqda, propidium yodid flüoresan rezonans enerjisinin ötürülməsi (FRET) ilə akridin narıncı flüoresansında azalmaya səbəb olur.Nəticədə, membranları zədələnmiş nüvəli hüceyrələr floresan yaşıl rəngə boyanır və canlı sayılır, halbuki zədələnmiş membranları olan nüvəli hüceyrələr yalnız flüoresan qırmızı rəngə boyanır və Countstar® FL sistemindən istifadə edərkən ölü sayılırlar.Qırmızı qan hüceyrələri, trombositlər və zibil kimi nüvəsiz material floresan etmir və Countstar® FL proqramı tərəfindən nəzərə alınmır.
Eksperimental prosedur:
1.PBMC nümunəsini PBS ilə 5 müxtəlif konsentrasiyada seyreltin;
2. 12µl AO/PI məhlulunu 12µl nümunəyə əlavə edin, pipetlə yumşaq qarışdırın;
3. 20µl qarışığı kamera slaydına çəkin;
4.Hüceyrələrin təxminən 1 dəqiqə kamerada yerləşməsinə icazə verin;
5.Slaydı Countstar FL alətinə daxil edin;
6. “AO/PI Viability” analizini seçin, sonra Countstar FL tərəfindən test edin.
Diqqət: AO və PI potensial kanserogendir.Dəri və gözlərlə birbaşa təmasdan qaçmaq üçün operatora fərdi qoruyucu vasitələr (PPE) taxması tövsiyə olunur.
Nəticə:
1.PBMC-nin Parlaq Sahə və Flüoresan şəkilləri
AO və PI boyası hər ikisi hüceyrələrin hüceyrə nüvəsində DNT-ni ləkələyir.Buna görə də, trombositlər, qırmızı qan hüceyrələri və ya hüceyrə zibilləri PBMC-lərin konsentrasiyasına və canlılığına təsir göstərə bilməz.Canlı hüceyrələr, ölü hüceyrələr və zibil Countstar FL tərəfindən yaradılmış şəkillər əsasında asanlıqla fərqləndirilə bilər (Şəkil 1).
Şəkil 2．PBMC-nin Parlaq Sahə və Flüoresan şəkilləri
2. PBMC-nin konsentrasiyası və canlılığı
PBMC nümunələri PBS ilə 2, 4, 8 və 16 dəfə seyreltilmiş, sonra həmin nümunələr AO/PI boya qarışığı ilə inkubasiya edilmiş və müvafiq olaraq Countstar FL tərəfindən təhlil edilmişdir.PBMC-nin konsentrasiyası və canlılığının nəticəsi aşağıdakı şəkildə göstərilmişdir:
