Монануклеарныя клеткі перыферычнай крыві (МККК) часта апрацоўваюць для аддзялення ад суцэльнай крыві шляхам цэнтрыфугавання ў градыенце шчыльнасці.Гэтыя клеткі складаюцца з лімфацытаў (Т-клеткі, У-клеткі, NK-клеткі) і манацытаў, якія звычайна выкарыстоўваюцца ў галіне імуналогіі, клеткавай тэрапіі, інфекцыйных захворванняў і распрацоўкі вакцын.Маніторынг і аналіз жыццяздольнасці і канцэнтрацыі PBMC мае вырашальнае значэнне для клінічных лабараторый, фундаментальных медыцынскіх навуковых даследаванняў і вытворчасці імунных клетак.
Мал. 1. Ізаляваны PBMC з свежай крыві з градыентам шчыльнасці цэнтрыфугавання
Падлік AOPI падвойным флюарэсцэнтам - гэта тып аналізу, які выкарыстоўваецца для выяўлення канцэнтрацыі клетак і жыццяздольнасці.Раствор ўяўляе сабой камбінацыю акрыдынавага аранжавага колеру (зялёны флуоресцентный афарбоўка нуклеінавых кіслот) і пропидиума ёдыду (чырвонага флуоресцентного афарбоўвання нуклеінавых кіслот).Ёдыд пропидия (PI) - гэта фарбавальнік для выключэння мембран, які пранікае толькі ў клеткі з парушанымі мембранамі, а акрыдынавы аранжавы здольны пранікаць ва ўсе клеткі папуляцыі.Калі ў ядры прысутнічаюць абодва фарбавальнікі, ёдыд пропідыю выклікае памяншэнне флюарэсцэнцыі акрыдынавага аранжавага колеру за кошт флуоресцентного рэзананснага перадачы энергіі (FRET).У выніку ядровыя клеткі з непашкоджанымі мембранамі афарбоўваюцца ў флуоресцентный зялёны колер і лічацца жывымі, тады як клеткі з ядрамі з парушанымі мембранамі афарбоўваюць толькі ў флуоресцентный чырвоны колер і лічацца мёртвымі пры выкарыстанні сістэмы Countstar® FL.Без'ядравыя матэрыялы, такія як эрытрацыты, трамбацыты і абломкі, не флуоресцируют і ігнаруюцца праграмным забеспячэннем Countstar® FL.
Эксперыментальная працэдура:
1. Развядзіце ўзор PBMC у 5 розных канцэнтрацыях з PBS;
2. Дадайце 12 мкл раствора AO/PI ў 12 мкл пробы, акуратна змяшайце піпеткай;
3. Набярыце 20 мкл сумесі ў прадметнае шкло;
4. Дайце клеткам астацца ў камеры прыкладна на 1 хвіліну;
5.Насякомце слайд у інструмент Countstar FL;
6.Выберыце аналіз «AO/PI Viability», затым праверце Countstar FL.
Увага: AO і PI з'яўляецца патэнцыйным канцерогеном.Рэкамендуецца, каб аператар насіў сродкі індывідуальнай абароны (ЗІЗ), каб пазбегнуць непасрэднага кантакту са скурай і вачыма.
Вынік:
1. Яркае поле і флуоресцентные выявы PBMC
Фарбавальнікі AO і PI - гэта фарбавальнікі ДНК у клеткавым ядры клетак.Такім чынам, трамбацыты, эрытрацыты або клетачны смецце не могуць паўплываць на канцэнтрацыю PBMCs і вынік жыццяздольнасці.Жывыя клеткі, мёртвыя клеткі і смецце можна лёгка адрозніць на падставе малюнкаў, створаных Countstar FL (малюнак 1).
Малюнак 2. Яркае поле і флуоресцентные выявы PBMC
2.Канцэнтрацыя і жыццяздольнасць PBMC
Узоры PBMC разводзілі ў 2, 4, 8 і 16 разоў PBS, затым гэтыя ўзоры інкубавалі з сумессю фарбавальнікаў AO/PI і аналізавалі Countstar FL адпаведна.Вынік канцэнтрацыі і жыццяздольнасці PBMC паказаны на малюнку ніжэй:
