Аналіз лейкацытаў у суцэльнай крыві з'яўляецца звычайным аналізам у клінічнай лабараторыі або банку крыві.Канцэнтрацыя і жыццяздольнасць лейкацытаў з'яўляюцца жыццёва важным паказчыкам для кантролю якасці захоўвання крыві.Акрамя лейкацытаў, суцэльная кроў змяшчае вялікую колькасць трамбацытаў, эрытрацытаў або клетачных рэшткаў, што робіць немагчымым аналіз суцэльнай крыві непасрэдна пад мікраскопам або лічыльнікам клетак з яркім полем.Звычайныя метады падліку лейкацытаў уключаюць працэс лізісу эрытрацытаў, які займае шмат часу.
Падлік AOPI падвойным флюарэсцэнтам - гэта тып аналізу, які выкарыстоўваецца для выяўлення канцэнтрацыі клетак і жыццяздольнасці.Раствор ўяўляе сабой камбінацыю акрыдынавага аранжавага колеру (зялёны флуоресцентный афарбоўка нуклеінавых кіслот) і пропидиума ёдыду (чырвонага флуоресцентного афарбоўвання нуклеінавых кіслот).Ёдыд пропидия (PI) - гэта фарбавальнік для выключэння мембран, які пранікае толькі ў клеткі з парушанымі мембранамі, а акрыдынавы аранжавы здольны пранікаць ва ўсе клеткі папуляцыі.Калі ў ядры прысутнічаюць абодва фарбавальнікі, ёдыд пропідыю выклікае памяншэнне флюарэсцэнцыі акрыдынавага аранжавага колеру за кошт флуоресцентного рэзананснага перадачы энергіі (FRET).У выніку ядровыя клеткі з непашкоджанымі мембранамі афарбоўваюцца ў флуоресцентный зялёны колер і лічацца жывымі, тады як клеткі з ядрамі з парушанымі мембранамі афарбоўваюць толькі ў флуоресцентный чырвоны колер і лічацца мёртвымі пры выкарыстанні сістэмы Countstar® Rigel.
Countstar Rigel з'яўляецца ідэальным рашэннем для многіх складаных аналізаў папуляцыі клетак, якія дазваляюць хутка аналізаваць лейкацыты ў суцэльнай крыві.
Эксперыментальная працэдура:
1. Вазьміце 20 мкл пробы крыві і развядзіце ўзор у 180 мкл PBS.
2. Дадайце 12 мкл раствора AO/PI ў 12 мкл пробы, акуратна змяшайце піпеткай;
3. Набярыце 20 мкл сумесі ў прадметнае шкло;
4. Дайце клеткам астацца ў камеры прыкладна на 1 хвіліну;
5.Насякомце слайд у інструмент Countstar FL;
6. Выберыце аналіз «Жывальнасць AO/PI», затым увядзіце ідэнтыфікатар пробы для гэтага ўзору.
7. Выберыце Каэфіцыент развядзення, Тып ячэек, націсніце кнопку «Выканаць», каб пачаць тэст.
Увага: AO і PI з'яўляецца патэнцыйным канцерогеном.Рэкамендуецца, каб аператар насіў сродкі індывідуальнай абароны (ЗІЗ), каб пазбегнуць непасрэднага кантакту са скурай і вачыма.
Вынік:
1. Яркае поле Выява суцэльнай крыві
На малюнку ў яркім полі цэлай крыві лейкацыты не бачныя сярод эрытрацытаў.(Малюнак 1)
Малюнак 1 Яркае поле выявы суцэльнай крыві.
2. Флуарэсцэнтны малюнак суцэльнай крыві
Фарбавальнікі AO і PI - гэта фарбавальнікі ДНК у клеткавым ядры клетак.Такім чынам, трамбацыты, эрытрацыты або клетачны дэфіцыт не могуць паўплываць на канцэнтрацыю лейкацытаў і вынік жыццяздольнасці.Жывыя лейкацыты (зялёны) і мёртвыя лейкацыты (чырвоны) лёгка візуалізаваць на флюарэсцэнтных малюнках.(Малюнак 2)
Малюнак 2 Флуарэсцэнцыі Выявы суцэльнай крыві.(А).Выява канала АТ;(B) выява PI Channel;(C) Аб'яднаць выявы AO і PI канала.
3. Канцэнтрацыя і жыццяздольнасць лейкацытаў
Праграмнае забеспячэнне Countstar FL аўтаматычна падлічвае клеткі трох секцый камеры і разлічвае сярэдняе значэнне агульнай колькасці лейкацытаў (1202), канцэнтрацыі (1,83 х 106 клетак/мл) і % жыццяздольнасці (82,04%).Выявы і дадзеныя суцэльнай крыві можна лёгка экспартаваць у PDF, малюнак або Excel для дадатковага аналізу або архівавання дадзеных.
Малюнак 3 Скрыншот праграмы Countstar Rigel Software
