Мононуклеарните клетки на периферната кръв (PBMCs) често се обработват, за да се отделят от цяла кръв чрез центрофугиране с градиент на плътност.Тези клетки се състоят от лимфоцити (Т клетки, В клетки, NK клетки) и моноцити, които обикновено се използват в областта на имунологията, клетъчната терапия, инфекциозните заболявания и разработването на ваксини.Мониторингът и анализирането на жизнеспособността и концентрацията на PBMC е от решаващо значение за клиничните лаборатории, основните медицински научни изследвания и производството на имунни клетки.
Фигура 1. Изолиран PBMC от прясна кръв с центрофугиране с градиент на плътност
AOPI двойно-флуоресцентно броене е типът анализ, използван за откриване на клетъчна концентрация и жизнеспособност.Разтворът е комбинация от акридиново оранжево (зелено-флуоресцентно оцветяване на нуклеинова киселина) и пропидиев йодид (червено-флуоресцентно оцветяване с нуклеинова киселина).Пропидиев йодид (PI) е багрило за изключване на мембраната, което влиза само в клетки с компрометирани мембрани, докато акридин портокалът е в състояние да проникне във всички клетки в популацията.Когато и двете багрила присъстват в ядрото, пропидиевият йодид причинява намаляване на акридиново оранжевата флуоресценция чрез флуоресцентен резонансен пренос на енергия (FRET).В резултат на това клетките с ядра с непокътнати мембрани оцветяват флуоресцентно зелено и се считат за живи, докато нуклеираните клетки с компрометирани мембрани оцветяват само флуоресцентно червено и се броят като мъртви, когато се използва системата Countstar® FL.Безядрени материали като червени кръвни клетки, тромбоцити и остатъци не флуоресцират и се игнорират от софтуера Countstar® FL.
Експериментална процедура:
1.Разредете PBMC пробата в 5 различни концентрации с PBS;
2. Добавете 12 µl AO/PI разтвор в 12 µl проба, внимателно разбъркайте с пипета;
3. Изтеглете 20 µl смес в предметно стъкло;
4. Оставете клетките да се утаят в камерата за около 1 минута;
5. Инсектирайте пързалката в инструмента Countstar FL;
6. Изберете анализа „AO/PI Viability“ и след това тествайте от Countstar FL.
Внимание: AO и PI са потенциален канцероген.Препоръчва се операторът да носи лични предпазни средства (ЛПС), за да избегне директен контакт с кожата и очите.
Резултат:
1. Ярко поле и флуоресцентни изображения на PBMC
И двете багрила AO и PI оцветяват ДНК в клетъчното ядро на клетките.Следователно тромбоцитите, червените кръвни клетки или клетъчните остатъци не могат да повлияят на концентрацията на PBMC и резултата от жизнеспособността.Живите клетки, мъртвите клетки и остатъците могат лесно да бъдат разграничени въз основа на изображенията, генерирани от Countstar FL (Фигура 1).
Фигура 2. Ярко поле и флуоресцентни изображения на PBMC
2. Концентрация и жизнеспособност на PBMC
PBMC пробите се разреждат 2, 4, 8 и 16 пъти с PBS, след което тези проби се инкубират със смес от багрила AO/PI и се анализират съответно от Countstar FL.Резултатът от концентрацията и жизнеспособността на PBMC е показан на фигурата по-долу:
