Анализирането на левкоцитите в цяла кръв е рутинен анализ в клинична лаборатория или кръвна банка.Концентрацията и жизнеспособността на левкоцитите са жизненоважният показател като контрол на качеството на съхранението на кръвта.Освен левкоцитите, цялата кръв съдържа голям брой тромбоцити, червени кръвни клетки или клетъчни остатъци, които правят невъзможно анализирането на цяла кръв директно под микроскоп или брояч на клетки с ярко поле.Конвенционалните методи за преброяване на белите кръвни клетки включват процес на лизиране на червените кръвни клетки, който отнема време.
AOPI двойно-флуоресцентно броене е типът анализ, използван за откриване на клетъчна концентрация и жизнеспособност.Разтворът е комбинация от акридиново оранжево (зелено-флуоресцентно оцветяване на нуклеинова киселина) и пропидиев йодид (червено-флуоресцентно оцветяване с нуклеинова киселина).Пропидиев йодид (PI) е багрило за изключване на мембраната, което влиза само в клетки с компрометирани мембрани, докато акридин портокалът е в състояние да проникне във всички клетки в популацията.Когато и двете багрила присъстват в ядрото, пропидиевият йодид причинява намаляване на акридиново оранжевата флуоресценция чрез флуоресцентен резонансен пренос на енергия (FRET).В резултат на това клетките с ядра с непокътнати мембрани оцветяват флуоресцентно зелено и се считат за живи, докато нуклеираните клетки с компрометирани мембрани оцветяват само флуоресцентно червено и се броят като мъртви, когато се използва системата Countstar® Rigel.
Countstar Rigel е идеално решение за много сложни анализи за характеризиране на клетъчната популация, позволявайки бързо да се анализират белите кръвни клетки в цяла кръв.
Експериментална процедура:
1. Вземете 20 µl кръвна проба и разредете пробата в 180 µl PBS.
2. Добавете 12 µl AO/PI разтвор в 12 µl проба, внимателно разбъркайте с пипета;
3. Изтеглете 20 µl смес в предметно стъкло;
4. Оставете клетките да се утаят в камерата за около 1 минута;
5. Инсектирайте пързалката в инструмента Countstar FL;
6. Изберете анализа “AO/PI Viability” и след това въведете идентификатор на пробата за тази проба.
7. Изберете Съотношение на разреждане, Тип клетка, щракнете върху 'Run', за да започнете теста.
Внимание: AO и PI са потенциален канцероген.Препоръчва се операторът да носи лични предпазни средства (ЛПС), за да избегне директен контакт с кожата и очите.
Резултат:
1. Bright Field Изображение на цяла кръв
В изображението на яркото поле на цялата кръв WBC не се виждат сред червените кръвни клетки.(Фигура 1)
Фигура 1 Изображение с ярко поле на цяла кръв.
2. Флуоресцентно изображение на цяла кръв
И двете багрила AO и PI оцветяват ДНК в клетъчното ядро на клетките.Следователно тромбоцитите, червените кръвни клетки или клетъчните остатъци не могат да повлияят на концентрацията на левкоцитите и резултата от жизнеспособността.Живите левкоцити (зелени) и мъртвите левкоцити (червени) се визуализират лесно във флуоресцентните изображения.(Фигура 2)
Фигура 2 Флуоресцентни изображения на цяла кръв.(А).Изображение на AO канал;(B) Изображение на PI Channel;(C) Обединете изображения на AO и PI канал.
3. Концентрация и жизнеспособност на левкоцитите
Софтуерът Countstar FL автоматично преброява клетки от три камерни секции и изчислява средна стойност на общия брой на WBC клетки (1202), концентрация (1,83 x 106 клетки/ml) и % жизнеспособност (82,04%).Изображенията и данните от цяла кръв могат лесно да бъдат експортирани като PDF, Image или Excel за допълнителен анализ или архивиране на данни.
Фигура 3 Екранна снимка на софтуера Countstar Rigel
