পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার সেল (PBMCs) প্রায়শই ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে পুরো রক্ত থেকে আলাদা করার জন্য প্রক্রিয়া করা হয়।এই কোষগুলি লিম্ফোসাইট (টি কোষ, বি কোষ, এন কে কোষ) এবং মনোসাইট নিয়ে গঠিত, যা সাধারণত ইমিউনোলজি, সেল থেরাপি, সংক্রামক রোগ এবং ভ্যাকসিন বিকাশের ক্ষেত্রে ব্যবহৃত হয়।ক্লিনিকাল ল্যাবরেটরি, বেসিক মেডিক্যাল সায়েন্স রিসার্চ এবং ইমিউন সেল উৎপাদনের জন্য PBMC এর কার্যকারিতা এবং ঘনত্ব পর্যবেক্ষণ ও বিশ্লেষণ করা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
চিত্র 1. ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট সেন্ট্রিফিউগেশন সহ তাজা রক্ত থেকে বিচ্ছিন্ন PBMC
AOPI ডুয়াল-ফ্লুরোসেস গণনা হল কোষের ঘনত্ব এবং কার্যকারিতা সনাক্ত করার জন্য ব্যবহৃত অ্যাসের ধরন।সমাধান হল অ্যাক্রিডিন কমলা (সবুজ-ফ্লুরোসেন্ট নিউক্লিক অ্যাসিড দাগ) এবং প্রপিডিয়াম আয়োডাইড (লাল-ফ্লুরোসেন্ট নিউক্লিক অ্যাসিড দাগ) এর সংমিশ্রণ।প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) হল একটি মেমব্রেন এক্সক্লুশন ডাই যা শুধুমাত্র আপোসকৃত ঝিল্লির কোষে প্রবেশ করে, যখন অ্যাক্রিডিন কমলা জনসংখ্যার সমস্ত কোষে প্রবেশ করতে সক্ষম।যখন উভয় রঞ্জক নিউক্লিয়াসে উপস্থিত থাকে, তখন প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড ফ্লুরোসেন্স রেজোন্যান্স এনার্জি ট্রান্সফার (FRET) দ্বারা অ্যাক্রিডাইন কমলা প্রতিপ্রভা হ্রাস করে।ফলস্বরূপ, অক্ষত ঝিল্লি সহ নিউক্লিয়েটেড কোষগুলি ফ্লুরোসেন্ট সবুজ দাগ দেয় এবং লাইভ হিসাবে গণনা করা হয়, যেখানে আপোসকৃত ঝিল্লি সহ নিউক্লিয়েটেড কোষগুলি শুধুমাত্র ফ্লুরোসেন্ট লাল দাগ দেয় এবং Countstar® FL সিস্টেম ব্যবহার করার সময় মৃত হিসাবে গণনা করা হয়।লোহিত রক্তকণিকা, প্লেটলেট এবং ধ্বংসাবশেষের মতো অ-নিউক্লিয়েটেড উপাদান ফ্লুরোস হয় না এবং Countstar® FL সফ্টওয়্যার দ্বারা উপেক্ষা করা হয়।
পরীক্ষামূলক পদ্ধতি:
1. PBMC নমুনাকে PBS দিয়ে 5টি ভিন্ন ঘনত্বে পাতলা করুন;
2. 12µl AO/PI দ্রবণ 12µl নমুনায় যোগ করুন, আস্তে আস্তে পিপেটের সাথে মিশ্রিত করুন;
3. চেম্বার স্লাইডে 20µl মিশ্রণ আঁকুন;
4. কোষগুলিকে প্রায় 1 মিনিটের জন্য চেম্বারে বসতে দিন;
5. কাউন্টস্টার এফএল ইন্সট্রুমেন্টে স্লাইডটিকে পোকা দিন;
6. "AO/PI কার্যকারিতা" পরীক্ষা নির্বাচন করুন, তারপর কাউন্টস্টার এফএল দ্বারা পরীক্ষা করুন৷
সতর্কতা: AO এবং PI একটি সম্ভাব্য কার্সিনোজেন।ত্বক এবং চোখের সাথে সরাসরি যোগাযোগ এড়াতে অপারেটরকে ব্যক্তিগত সুরক্ষামূলক সরঞ্জাম (PPE) পরার পরামর্শ দেওয়া হয়।
ফলাফল:
1. PBMC এর উজ্জ্বল ক্ষেত্র এবং ফ্লুরোসেন্স ছবি
AO এবং PI রঞ্জক উভয়ই কোষের কোষের নিউক্লিয়াসে দাগ ডিএনএ।অতএব, প্লেটলেট, লোহিত রক্তকণিকা, বা সেলুলার ধ্বংসাবশেষ PBMC-এর ঘনত্ব এবং কার্যকারিতা ফলাফলকে প্রভাবিত করতে অক্ষম।কাউন্টস্টার এফএল (চিত্র 1) দ্বারা উত্পন্ন চিত্রের ভিত্তিতে জীবিত কোষ, মৃত কোষ এবং ধ্বংসাবশেষ সহজেই আলাদা করা যেতে পারে।
চিত্র 2. PBMC এর উজ্জ্বল ক্ষেত্র এবং ফ্লুরোসেন্স চিত্র
2. PBMC এর ঘনত্ব এবং কার্যকারিতা
পিবিএমসি নমুনাগুলি পিবিএসের সাথে 2, 4, 8 এবং 16 বার পাতলা করা হয়েছিল, তারপর সেই নমুনাগুলিকে একটি AO/PI ডাই মিশ্রণ দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং যথাক্রমে কাউন্টস্টার এফএল দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।PBMC এর ঘনত্ব এবং কার্যকারিতার ফলাফল নীচের চিত্র হিসাবে দেখানো হয়েছে:
