Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) se često obrađuju da se odvoje od pune krvi centrifugiranjem s gradijentom gustine.Te ćelije se sastoje od limfocita (T ćelije, B ćelije, NK ćelije) i monocita, koji se obično koriste u oblasti imunologije, ćelijske terapije, zaraznih bolesti i razvoja vakcina.Praćenje i analiza održivosti i koncentracije PBMC je od ključnog značaja za kliničke laboratorije, istraživanja osnovnih medicinskih nauka i proizvodnju imunoloških ćelija.
Slika 1. Izolovani PBMC iz svježe krvi centrifugiranjem s gradijentom gustine
AOPI Dual-fluorescent counting je tip testa koji se koristi za otkrivanje koncentracije i vitalnosti ćelija.Rješenje je kombinacija akridin narandže (zeleno-fluorescentna boja nukleinske kiseline) i propidijum jodida (crvena fluorescentna boja nukleinske kiseline).Propidijum jodid (PI) je membranska ekskluziona boja koja ulazi samo u ćelije sa ugroženim membranama, dok akridin narandžasta može da prodre u sve ćelije u populaciji.Kada su obe boje prisutne u jezgru, propidijum jodid uzrokuje smanjenje akridin narandžaste fluorescencije putem fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (FRET).Kao rezultat toga, ćelije sa jezgrom sa netaknutim membranama boje se fluorescentno zelenom bojom i računaju se kao žive, dok ćelije sa jezgrom sa ugroženim membranama boje samo fluorescentno crveno i računaju se kao mrtve kada se koristi Countstar® FL sistem.Materijali bez jezgre kao što su crvena krvna zrnca, trombociti i debris ne fluoresciraju i Countstar® FL softver ih ignorira.
Eksperimentalni postupak:
1. Razblažite uzorak PBMC u 5 različitih koncentracija sa PBS;
2.Dodajte 12 µl AO/PI rastvora u 12 µl uzorka, lagano pomešajte pipetom;
3. Uvucite 20 µl smjese u staklo komore;
4. Dozvolite ćelijama da se talože u komori oko 1 minut;
5. Insektirajte klizač u instrument Countstar FL;
6.Odaberite test “AO/PI Viability”, a zatim ga testirajte od strane Countstar FL.
Oprez: AO i PI su potencijalni kancerogen.Preporučuje se da operater nosi ličnu zaštitnu opremu (PPE) kako bi izbjegao direktan kontakt s kožom i očima.
rezultat:
1. Bright Field i Fluorescence slike PBMC
AO i PI boja obojene su DNK u ćelijskom jezgru ćelija.Stoga, trombociti, crvena krvna zrnca ili ćelijski ostaci ne mogu utjecati na koncentraciju PBMC-a i rezultat održivosti.Žive ćelije, mrtve ćelije i ostaci mogu se lako razlikovati na osnovu slika koje je generisao Countstar FL (Slika 1).
Slika 2．Bright Field i Fluorescence slike PBMC
2. Koncentracija i održivost PBMC-a
Uzorci PBMC su razrijeđeni 2, 4, 8 i 16 puta sa PBS, zatim su ti uzorci inkubirani sa AO/PI mješavinom boja i analizirani od strane Countstar FL respektivno.Rezultat koncentracije i održivosti PBMC-a prikazan je na slici ispod:
