El sistema Countstar combina el citòmetre d'imatge i el comptador de cèl·lules en un únic instrument de sobretaula.Aquest sistema d'imatge cel·lular, compacte i automatitzat, basat en aplicacions, proporciona una solució tot en un per a la investigació de cèl·lules canceroses, inclòs el recompte de cèl·lules, la viabilitat (AO/PI, blau tripà), l'apoptosi (Annexina V-FITC/PI), la cèl·lula cicle (PI) i transfecció GFP/RFP.
Resum
El càncer és una de les principals causes de mort a tot el món, i el desenvolupament de nous mètodes de tractament del càncer és de gran importància.La cèl·lula cancerosa és l'objecte d'investigació bàsica del càncer, s'ha d'avaluar diversa informació de la cèl·lula cancerosa.Aquesta àrea de recerca necessita una anàlisi cel·lular ràpida, fiable, senzilla i detallada.El sistema Countstar proporciona una plataforma de solució senzilla per a l'anàlisi de cèl·lules canceroses.
Estudi de l'apoptosi de cèl·lules canceroses per Countstar Rigel
Els assaigs d'apoptosi s'utilitzen habitualment en molts laboratoris amb finalitats variades, des de l'avaluació de la salut dels cultius cel·lulars fins a l'avaluació de la toxicitat d'un panell de compostos.
L'assaig d'apoptosi és un tipus que s'utilitza per determinar el percentatge d'apoptosi de les cèl·lules mitjançant el mètode de tinció d'Annexina V-FITC/PI.L'annexina V s'uneix a la fosfatidilserina (PS) amb cèl·lules d'apoptosi primerenca o cèl·lules de necrosi.El PI només entra a les cèl·lules apoptòtiques necròtiques/en fase molt tardana.(Figura 1)
A: Apoptosi precoç Annexina V (+), PI (-)
B: apoptosi tardana Annexina V (+), PI (+)
Figura 1: detalls ampliats de les imatges de Countstar Rigel (augment de 5 x) de 293 cèl·lules, tractades amb Annexin V FITC i PI
Anàlisi del cicle cel·lular de cèl·lules canceroses
El cicle cel·lular o cicle de divisió cel·lular és la sèrie d'esdeveniments que tenen lloc en una cèl·lula que condueixen a la seva divisió i duplicació del seu ADN (replicació de l'ADN) per produir dues cèl·lules filles.A les cèl·lules amb nucli, com en els eucariotes, el cicle cel·lular també es divideix en tres períodes: la interfase, la fase mitòtica (M) i la citocinesi.El iodur de propidi (PI) és un colorant de tinció nuclear que s'utilitza amb freqüència per mesurar el cicle cel·lular.Com que el colorant no pot entrar a les cèl·lules vives, les cèl·lules es fixen amb etanol abans de la tinció.Tot seguit es tenyeixen totes les cèl·lules.Les cèl·lules que es preparen per a la divisió contindran quantitats creixents d'ADN i mostraran una fluorescència proporcionalment augmentada.Les diferències en la intensitat de la fluorescència s'utilitzen per determinar el percentatge de cèl·lules en cada fase del cicle cel·lular.Countstar pot capturar la imatge i els resultats es mostraran al programari FCS express.(Figura 2)
Figura 2: MCF-7 (A) i 293T (B) es van tacar amb el kit de detecció del cicle cel·lular amb PI, els resultats van ser determinats per Countstar Rigel i analitzats per FCS express.
Determinació de la viabilitat i la transfecció de GFP a la cèl·lula
Durant el bioprocés, la GFP s'utilitza sovint per fusionar-se amb proteïnes recombinants com a indicador.Determineu que la llauna fluorescent GFP reflecteix l'expressió de la proteïna diana.Countstar Rigel ofereix un assaig ràpid i senzill per provar la transfecció de GFP així com la viabilitat.Les cèl·lules es van tenyir amb iodur de propidi (PI) i Hoechst 33342 per definir la població de cèl·lules mortes i la població total de cèl·lules.Countstar Rigel ofereix un mètode ràpid i quantitatiu per avaluar l'eficiència i la viabilitat de l'expressió GFP al mateix temps.(Figura 4)
Figura 4: Les cèl·lules es localitzen mitjançant Hoechst 33342 (blau) i es pot determinar fàcilment el percentatge de cèl·lules que expressen GFP (verd).Les cèl·lules no viables es tenyeixen amb iodur de propidi (PI; vermell).
Viabilitat i recompte de cèl·lules
El recompte de fluorescències dual AO/PI és el tipus d'assaig utilitzat per detectar la concentració cel·lular i la viabilitat.Es va dividir en recompte de línies cel·lulars i recompte de cèl·lules primàries segons diferents tipus de cèl·lules.La solució conté una combinació de la taca d'àcid nucleic fluorescent verd, taronja d'acridina, i la taca d'àcid nucleic fluorescent vermella, iodur de propidi.El iodur de propidi és un colorant d'exclusió de membrana que només entra a les cèl·lules amb membranes compromeses mentre que la taronja d'acridina penetra a totes les cèl·lules d'una població.Quan els dos colorants estan presents al nucli, el iodur de propidi provoca una reducció de la fluorescència taronja d'acridina mitjançant la transferència d'energia de ressonància de fluorescència (FRET).Com a resultat, les cèl·lules nucleades amb membranes intactes es taquen de color verd fluorescent i es compten com a vives, mentre que les cèl·lules nucleades amb membranes compromeses només es taquen de vermell fluorescent i es compten com a mortes quan s'utilitzen el sistema Countstar Rigel.El material no nuclear com els glòbuls vermells, les plaquetes i els residus no fan fluorescència i el programari Countstar Rigel els ignora.(Figura 5)
Figura 5: Countstar ha optimitzat un mètode de tinció de fluorescència dual per a una determinació senzilla i precisa de la concentració i la viabilitat de PBMC.Les mostres tacades amb AO/PI es poden analitzar amb el Counstar Rigel
