Les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) sovint es processen per separar-se de la sang sencera mitjançant la centrifugació del gradient de densitat.Aquestes cèl·lules estan formades per limfòcits (cèl·lules T, cèl·lules B, cèl·lules NK) i monòcits, utilitzats habitualment en el camp de la immunologia, la teràpia cel·lular, les malalties infeccioses i el desenvolupament de vacunes.El seguiment i l'anàlisi de la viabilitat i la concentració de PBMC és crucial per als laboratoris clínics, la investigació bàsica de la ciència mèdica i la producció de cèl·lules immunitàries.
Fig 1. PBMC aïllat de sang fresca amb centrifugació amb gradient de densitat
El recompte de fluorescències dual AOPI és el tipus d'assaig utilitzat per detectar la concentració i la viabilitat cel·lular.La solució és una combinació de taronja d'acridina (la taca d'àcid nucleic fluorescent verd) i iodur de propidi (la taca d'àcid nucleic fluorescent vermell).El iodur de propidi (PI) és un colorant d'exclusió de membrana que només entra a les cèl·lules amb membranes compromeses, mentre que la taronja d'acridina és capaç de penetrar totes les cèl·lules d'una població.Quan els dos colorants estan presents al nucli, el iodur de propidi provoca una reducció de la fluorescència taronja d'acridina mitjançant la transferència d'energia de ressonància de fluorescència (FRET).Com a resultat, les cèl·lules nucleades amb membranes intactes es taquen de color verd fluorescent i es compten com a vives, mentre que les cèl·lules nucleades amb membranes compromeses només es taquen de vermell fluorescent i es compten com a mortes quan s'utilitzen el sistema Countstar® FL.El material no nuclear com els glòbuls vermells, les plaquetes i els residus no emet fluorescència i el programari Countstar® FL ignora.
Procediment experimental:
1.Diluïu la mostra de PBMC en 5 concentracions diferents amb PBS;
2.Afegiu 12 µl de solució AO/PI a 12 µl de mostra, barrejat suaument amb una pipeta;
3. Dibuixeu 20 µl de barreja a la diapositiva de la cambra;
4.Deixeu que les cèl·lules s'assentin a la cambra durant aproximadament 1 minut;
5.Insecteu la diapositiva a l'instrument Countstar FL;
6. Trieu l'assaig "AO/PI Viability" i, a continuació, proveu Countstar FL.
Precaució: AO i PI són cancerígens potencials.Es recomana que l'operador porti equip de protecció individual (EPI) per evitar el contacte directe amb la pell i els ulls.
Resultat:
1.Imatges de camp brillant i fluorescència del PBMC
El colorant AO i PI són taques d'ADN al nucli cel·lular de les cèl·lules.Per tant, les plaquetes, els glòbuls vermells o les restes cel·lulars no poden afectar la concentració i el resultat de viabilitat dels PBMC.Les cèl·lules vives, les cèl·lules mortes i els residus es poden distingir fàcilment a partir de les imatges generades per Countstar FL (figura 1).
Figura 2. Imatges de camp brillant i fluorescència del PBMC
2.Concentració i viabilitat de PBMC
Les mostres de PBMC es van diluir en 2, 4, 8 i 16 vegades amb PBS, després es van incubar aquestes mostres amb una barreja de colorants AO/PI i es van analitzar per Countstar FL respectivament.El resultat de la concentració i la viabilitat de PBMC es mostra a la figura següent:
