L'anàlisi dels leucòcits a la sang sencera és un assaig de rutina al laboratori clínic o al banc de sang.La concentració i la viabilitat dels leucòcits són l'índex vital com a control de qualitat de l'emmagatzematge de sang.A part dels leucòcits, la sang sencera conté un gran nombre de plaquetes, glòbuls vermells o restes cel·lulars, que fan impossible analitzar la sang sencera directament al microscopi o al comptador de cèl·lules de camp brillant.Els mètodes convencionals per comptar els glòbuls blancs impliquen un procés de lisi de glòbuls, que requereix molt de temps.
El recompte de fluorescències dual AOPI és el tipus d'assaig utilitzat per detectar la concentració i la viabilitat cel·lular.La solució és una combinació de taronja d'acridina (la taca d'àcid nucleic fluorescent verd) i iodur de propidi (la taca d'àcid nucleic fluorescent vermell).El iodur de propidi (PI) és un colorant d'exclusió de membrana que només entra a les cèl·lules amb membranes compromeses, mentre que la taronja d'acridina és capaç de penetrar totes les cèl·lules d'una població.Quan els dos colorants estan presents al nucli, el iodur de propidi provoca una reducció de la fluorescència taronja d'acridina mitjançant la transferència d'energia de ressonància de fluorescència (FRET).Com a resultat, les cèl·lules nucleades amb membranes intactes es taquen de color verd fluorescent i es compten com a vives, mentre que les cèl·lules nucleades amb membranes compromeses només es taquen de vermell fluorescent i es compten com a mortes quan s'utilitzen el sistema Countstar® Rigel.
Countstar Rigel és una solució ideal per a molts assaigs complexos de caracterització de poblacions cel·lulars, que permeten analitzar ràpidament els glòbuls blancs de la sang sencera.
Procediment experimental:
1. Agafeu 20 µl de mostra de sang i diluïu la mostra en 180 µl de PBS.
2.Afegiu 12 µl de solució AO/PI a 12 µl de mostra, barrejat suaument amb una pipeta;
3. Dibuixeu 20 µl de barreja a la diapositiva de la cambra;
4.Deixeu que les cèl·lules s'assentin a la cambra durant aproximadament 1 minut;
5.Insecteu la diapositiva a l'instrument Countstar FL;
6. Trieu l'assaig "Viabilitat AO/PI" i, a continuació, introduïu l'ID de la mostra per a aquesta mostra.
7.Seleccioneu Proporció de dilució, Tipus de cel·la, feu clic a "Executar" per iniciar la prova.
Precaució: AO i PI són cancerígens potencials.Es recomana que l'operador porti equip de protecció individual (EPI) per evitar el contacte directe amb la pell i els ulls.
Resultat:
1. Imatge de camp brillant de sang sencera
A la imatge de camp brillant de tota la sang, els glòbuls vermells no són visibles entre els glòbuls vermells.(Figura 1)
Figura 1 Imatge de camp brillant de sang sencera.
2. Fluorescència Imatge de sang sencera
El colorant AO i PI són taques d'ADN al nucli cel·lular de les cèl·lules.Per tant, les plaquetes, els glòbuls vermells o les restes cel·lulars no poden afectar la concentració de leucòcits i el resultat de la viabilitat.Els leucòcits vius (verd) i els leucòcits morts (vermell) es visualitzen fàcilment a les imatges de fluorescència.(Figura 2)
Figura 2 Imatges de fluorescència de sang sencera.(A).Imatge del canal AO;(B) Imatge de PI Channel;(C) Combina imatges del canal AO i PI.
3. Concentració i viabilitat dels leucòcits
El programari Countstar FL compta automàticament cèl·lules de tres seccions de cambra i calcula el valor mitjà del recompte total de cèl·lules WBC (1202), la concentració (1,83 x 106 cèl·lules/ml) i el % de viabilitat (82,04%).Les imatges i les dades de sang sencera es poden exportar fàcilment com a PDF, Imatge o Excel per a anàlisis addicionals o arxiu de dades.
Figura 3 Captura de pantalla del programari Countstar Rigel
