Ang peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) sagad giproseso aron mabulag gikan sa tibuok dugo pinaagi sa densidad nga gradient centrifugation.Ang maong mga selula gilangkoban sa mga lymphocyte (T cells, B cells, NK cells) ug monocytes, kasagarang gigamit sa natad sa immunology, cell therapy, makatakod nga sakit ug pagpalambo sa bakuna.Ang pagmonitor ug pagtuki sa viability ug konsentrasyon sa PBMC mahinungdanon alang sa clinical laboratories, batakang medikal nga siyensiya nga panukiduki ug immune cell production.
Fig 1. Gilain nga PBMC gikan sa presko nga dugo nga adunay Density gradient centrifugation
Ang pag-ihap sa AOPI Dual-fluoresces mao ang tipo sa assay nga gigamit alang sa pag-ila sa konsentrasyon sa cell ug kalagsik.Ang solusyon mao ang kombinasyon sa acridine orange (ang green-fluorescent nucleic acid stain) ug propidium iodide (ang red-fluorescent nucleic acid stain).Ang propidium iodide (PI) kay usa ka lamad nga exclusion dye nga musulod lang sa mga cell nga naay compromised membranes, samtang ang acridine orange kay makasulod sa tanang cell sa usa ka populasyon.Kung ang duha ka tina anaa sa nucleus, ang propidium iodide hinungdan sa pagkunhod sa acridine orange fluorescence pinaagi sa fluorescence resonance energy transfer (FRET).Ingon usa ka sangputanan, ang mga nucleated nga mga selyula nga adunay wala’y sulod nga mga lamad nagmantsa sa fluorescent nga berde ug giisip nga buhi, samtang ang mga nucleated nga mga selyula nga adunay nakompromiso nga mga lamad nagmantsa ra sa pula nga fluorescent ug giisip nga patay kung gigamit ang sistema sa Countstar® FL.Ang non-nucleated nga materyal sama sa pula nga mga selula sa dugo, mga platelet ug mga debris dili fluoresce ug gibalewala sa Countstar® FL software.
Eksperimental nga Pamaagi:
1. Dilute ang sample sa PBMC ngadto sa 5 ka lain-laing mga konsentrasyon sa PBS;
2.Idugang ang 12µl AO/PI nga solusyon sa 12µl sample, hinayhinay nga gisagol sa pipette;
3. Pagdrowing og 20µl mixture ngadto sa chamber slide;
4. Tugoti ang mga selula sa paghusay sa lawak sulod sa 1 ka minuto;
5. Insect ang slide ngadto sa Countstar FL instrument;
6. Pilia ang “AO/PI Viability” assay, unya sulayi sa Countstar FL.
Pasidaan: Ang AO ug PI usa ka potensyal nga carcinogen.Girekomenda nga magsul-ob og personal protective equipment (PPE) ang operator aron malikayan ang direktang kontak sa panit ug mata.
Resulta:
1.Bright Field ug Fluorescence nga mga hulagway sa PBMC
Ang AO ug PI nga tina kay parehong mantsa sa DNA sa cell nucleus sa mga selula.Busa, ang mga platelet, pula nga mga selula sa dugo, o cellular debris dili makaapektar sa konsentrasyon sa PBMC ug resulta sa viability.Ang buhi nga mga selula, patay nga mga selula ug mga tinumpag daling mailhan base sa mga hulagway nga gihimo sa Countstar FL (Figure 1).
Figure 2．Bright Field ug Fluorescence nga mga hulagway sa PBMC
2.Pagkonsentrar ug Kaayohan sa PBMC
Ang mga sampol sa PBMC natunaw sa 2, 4, 8 ug 16 ka beses nga adunay PBS, dayon ang mga sampol gilumlom sa usa ka sinagol nga tina nga AO / PI ug gisusi sa Countstar FL matag usa.Ang resulta sa konsentrasyon ug viability sa PBMC gipakita sa ubos nga numero:
