E cellule mononucleari di sangue perifericu (PBMC) sò spessu processate per separà da u sangue tutale per centrifugazione di gradiente di densità.Queste cellule sò custituiti da linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK) è monociti, cumunimenti usati in u campu di l'immunologia, a terapia cellulare, e malatie infettive è u sviluppu di vaccini.U monitoraghju è l'analisi di a viabilità è a cuncentrazione di PBMC hè cruciale per i laboratorii clinichi, a ricerca di basa in a scienza medica è a produzzione di cellule immune.
Fig 1. PBMC isolatu da u sangue frescu cù a centrifugazione di gradiente di Densità
AOPI Dual-fluoresces counting hè u tippu di analisi utilizatu per a rilevazione di a cuncentrazione cellulare è a viabilità.A suluzione hè cumminata di acridine orange (a macchia di l'acidu nucleicu fluoriscente verde) è di ioduru di propidium (a macchia di l'acidu nucleicu fluorescente rossu).L'ioduru di propidium (PI) hè un tintu d'esclusione di a membrana chì entra solu in e cellule cù membrani cumprumessi, mentri l'acridine orange hè capaci di penetrà tutte e cellule in una populazione.Quandu i dui tinti sò prisenti in u nucleu, l'ioduru di propidium provoca una riduzzione di a fluoriscenza acridina aranciu da u trasferimentu di l'energia di risonanza di fluorescenza (FRET).In u risultatu, e cellule nucleate cù membrani intacte macchianu di verde fluorescente è sò cuntate cum'è vivi, mentre chì e cellule nucleate cù membrani cumprumessi macchianu solu di rossu fluorescente è sò cuntate cum'è morte quandu utilizanu u sistema Countstar® FL.U materiale non-nucleatu cum'è i globuli rossi, i piastrini è i detriti ùn sò micca fluorescenti è sò ignorati da u software Countstar® FL.
Prucedura sperimentale:
1.Dilute a mostra PBMC in 5 cuncentrazioni diffirenti cù PBS;
2.Add 12 µl di soluzione AO/PI in 12 µl di campione, delicatamente mischiatu cù una pipetta;
3.Draw 20µl mistura in camera slide;
4.Allow i celluli di stallà in a camera per circa 1 minutu;
5.Insect u slide in u strumentu Countstar FL;
6.Choose l'assay "AO/PI Viability", poi pruvà da Countstar FL.
Attenzione: AO è PI hè un potenziale carcinogenu.Hè ricumandemu chì l'operatore portà l'equipaggiu di prutezzione persunale (PPE) per evità u cuntattu direttu cù a pelle è l'ochji.
Risultatu:
1.Bright Field and Fluorescence images di u PBMC
A tintura AO è PI sò tramindui macchie di DNA in u nucleu di e cellule.Per quessa, i piastrine, i globuli rossi, o i detriti cellulari ùn sò micca capaci di influenzà a cuncentrazione di PBMC è u risultatu di viabilità.Cellule viventi, cellule morte è detriti ponu esse facilmente distinti in basa di l'imaghjini generati da Countstar FL (Figura 1).
Figura 2．Imagine di Campu Luminoso è Fluorescenza di u PBMC
2.Concentrazione è Viabilità di PBMC
I campioni di PBMC sò stati diluiti in 2, 4, 8 è 16 volte cù PBS, poi quelli campioni sò stati incubati cù una mistura di tintura AO / PI è analizati da Countstar FL rispettivamente.U risultatu di cuncentrazione è viabilità di PBMC hè mostratu cum'è a figura sottu:
