L'analisi di i leucociti in u sangue sanu hè un esame di rutina in u laboratoriu clinicu o banca di sangue.A cuncentrazione è a viabilità di i leucociti sò l'indici vitali cum'è u cuntrollu di qualità di u almacenamentu di sangue.In più di i leucociti, u sangue sanu cuntene un gran numaru di platelets, globuli rossi, o debris cellulari, chì facenu impussibile di analizà u sangue sanu direttamente sottu à u microscopiu o u cuntatore di cellule di campu luminoso.I metudi cunvinziunali per cuntà i globuli bianchi implicanu u prucessu di lisi RBC, chì hè assai tempu.
AOPI Dual-fluoresces counting hè u tippu di analisi utilizatu per a rilevazione di a cuncentrazione cellulare è a viabilità.A suluzione hè cumminata di acridine orange (a macchia di l'acidu nucleicu fluoriscente verde) è di ioduru di propidium (a macchia di l'acidu nucleicu fluorescente rossu).L'ioduru di propidium (PI) hè un tintu d'esclusione di a membrana chì entra solu in e cellule cù membrani cumprumessi, mentri l'acridine orange hè capaci di penetrà tutte e cellule in una populazione.Quandu i dui tinti sò prisenti in u nucleu, l'ioduru di propidium provoca una riduzzione di a fluoriscenza acridina aranciu da u trasferimentu di l'energia di risonanza di fluorescenza (FRET).In u risultatu, e cellule nucleate cù membrani intacte macchianu di verde fluorescente è sò cuntate cum'è vivi, mentre chì e cellule nucleate cù membrani compromessi tinchenu solu di rossu fluorescente è sò cuntate cum'è morte quandu utilizanu u sistema Countstar® Rigel.
Countstar Rigel hè una soluzione ideale per assai saggi cumplessi di carattarizazione di a pupulazione di cellule, chì permettenu di analizà rapidamente i globuli bianchi in u sangue tutale.
Prucedura sperimentale:
1. Pigliate 20 µl di campione di sangue è diluite u campione in 180 µl di PBS.
2.Add 12 µl di soluzione AO/PI in 12 µl di campione, delicatamente mischiatu cù una pipetta;
3.Draw 20µl mistura in camera slide;
4.Allow i celluli di stallà in a camera per circa 1 minutu;
5.Insect u slide in u strumentu Countstar FL;
6.Choose l'assay "AO/PI Viability", poi Inserite Sample ID per questa mostra.
7.Select ratio Dilution, Cell Type, cliccate 'Run' per inizià a prova.
Attenzione: AO è PI hè un potenziale carcinogenu.Hè ricumandemu chì l'operatore portà l'equipaggiu di prutezzione persunale (PPE) per evità u cuntattu direttu cù a pelle è l'ochji.
Risultatu:
1. Bright Field Image di sangue sanu
In l'imaghjini di u campu luminoso di u sangue sanu, i WBC ùn sò micca visibili trà i globuli rossi.(Figura 1)
Figura 1 Immagine di campu luminoso di sangue sanu.
2. Fluorescenza Image di u sangue sanu
A tintura AO è PI sò tramindui macchie di DNA in u nucleu di e cellule.Dunque, i piastrine, i globuli rossi, o i detriti cellulare ùn sò micca capaci di influenzà a cuncentrazione di i leucociti è u risultatu di a viabilità.I leucociti vivi (verdi) è i leucociti morti (rossi) sò facilmente visualizati in l'imaghjini di fluorescenza.(Figura 2)
Figura 2 Fluorescenza Images di sangue sanu.(A).Image di AO Channel;(B) Image di PI Channel;(C) Unisce l'imaghjini di AO è PI Channel.
3. Cuncentrazione è viabilità di leucocytes
U software Countstar FL conta automaticamente e cellule di trè sezioni di camera è calcula u valore mediu di u cuntu totale di cellule WBC (1202), a cuncentrazione (1,83 x 106 cellule / ml) è u % di viabilità (82,04%).L'imaghjini è e dati di sangue interu ponu esse facilmente esportati cum'è PDF, Image o Excel per analisi supplementari o archiviazione di dati.
Figura 3 Screenshot di Countstar Rigel Software
