Systém Countstar kombinuje obrazový cytometr a počítadlo buněk do jediného stolního přístroje.Tento aplikačně řízený, kompaktní a automatizovaný systém zobrazování buněk poskytuje komplexní řešení pro výzkum rakovinných buněk, včetně počítání buněk, životaschopnosti (AO/PI, trypanová modř), apoptózy (Annexin V-FITC/PI), buněk cyklu (PI) a transfekce GFP/RFP.
Abstraktní
Rakovina je celosvětově jednou z hlavních příčin úmrtí a vývoj nových metod léčby rakoviny má velký význam.Rakovinná buňka je základním výzkumným objektem rakoviny, z rakovinné buňky je třeba vyhodnotit různé informace.Tato výzkumná oblast potřebuje rychlou, spolehlivou, jednoduchou a podrobnou analýzu buněk.Systém Countstar poskytuje jednoduchou platformu řešení pro analýzu rakovinných buněk.
Studie apoptózy rakovinných buněk podle Countstar Rigel
Testy apoptózy se rutinně používají v mnoha laboratořích pro různé účely od hodnocení zdraví buněčných kultur po hodnocení toxicity panelu sloučenin.
Test apoptózy je typ používaný pro stanovení procenta apoptózy buněk metodou barvení Annexin V-FITC/PI.Annexin V se váže na fosfatidylserin (PS) s buňkou časné apoptózy nebo nekrózou.PI vstupuje pouze do nekrotických/velmi pozdních apoptotických buněk.(Obrázek 1)
A: Včasná apoptóza Annexin V (+), PI (-)
B:Pozdní apoptóza Annexin V (+), PI (+)
Obrázek 1: Zvětšené detaily snímků Countstar Rigel (5x zvětšení) 293 buněk, ošetřených Annexinem V FITC a PI
Analýza buněčného cyklu rakovinné buňky
Buněčný cyklus nebo cyklus buněčného dělení je série událostí, které probíhají v buňce a vedou k jejímu dělení a duplikaci její DNA (replikace DNA) za vzniku dvou dceřiných buněk.U buněk s jádrem, stejně jako u eukaryot, je buněčný cyklus také rozdělen do tří období: interfáze, mitotická (M) fáze a cytokineze.Propidium jodid (PI) je barvivo pro barvení jader, které se často používá k měření buněčného cyklu.Protože barvivo nemůže vstoupit do živých buněk, jsou buňky před barvením fixovány ethanolem.Všechny buňky jsou pak obarveny.Buňky připravující se na dělení budou obsahovat rostoucí množství DNA a vykazují úměrně zvýšenou fluorescenci.Rozdíly v intenzitě fluorescence se používají ke stanovení procenta buněk v každé fázi buněčného cyklu.Countstar dokáže zachytit obrázek a výsledky se zobrazí v softwaru FCS Express.(Obrázek 2)
Obrázek 2: MCF-7 (A) a 293T (B) byly obarveny soupravou pro detekci buněčného cyklu s PI, výsledky byly stanoveny pomocí Countstar Rigel a analyzovány pomocí FCS express.
Stanovení životaschopnosti a GFP transfekce v buňce
Během bioprocesu se GFP často používá k fúzi s rekombinantním proteinem jako indikátorem.Určete, že fluorescence GFP může odrážet expresi cílového proteinu.Countstar Rigel nabízí rychlý a jednoduchý test pro testování transfekce GFP a také životaschopnosti.Buňky byly obarveny propidium jodidem (PI) a Hoechst 33342, aby se definovala populace mrtvých buněk a celková populace buněk.Countstar Rigel nabízí rychlou, kvantitativní metodu pro hodnocení účinnosti exprese GFP a zároveň životaschopnosti.(Obrázek 4)
Obrázek 4: Buňky jsou lokalizovány pomocí Hoechst 33342 (modrá) a procento buněk exprimujících GFP (zelené) lze snadno určit.Neživotaschopné buňky jsou obarveny propidium jodidem (PI; červená).
Životaschopnost a počet buněk
AO/PI Dual-fluoresces counting je typ testu používaný pro detekci buněčné koncentrace, životaschopnosti.Dělí se na počítání buněčných linií a počítání primárních buněk podle různých typů buněk.Roztok obsahuje kombinaci zeleně fluorescenčního barviva nukleové kyseliny, akridinové oranže, a červeného fluorescenčního barviva nukleové kyseliny, propidium jodid.Propidium jodid je membránové vylučovací barvivo, které vstupuje pouze do buněk s narušenými membránami, zatímco akridinová oranž proniká do všech buněk v populaci.Pokud jsou v jádře přítomna obě barviva, propidium jodid způsobí snížení fluorescence akridinové oranže přenosem fluorescenční rezonanční energie (FRET).V důsledku toho se buňky s jádry s neporušenými membránami barví fluorescenčně zeleně a jsou počítány jako živé, zatímco buňky s jádry s narušenými membránami se barví pouze fluorescenčně červeně a jsou počítány jako mrtvé při použití systému Countstar Rigel.Materiál bez jádra, jako jsou červené krvinky, krevní destičky a zbytky, nefluoreskují a software Countstar Rigel je ignoruje.(Obrázek 5)
Obrázek 5: Countstar optimalizoval metodu duálního fluorescenčního barvení pro jednoduché a přesné stanovení koncentrace a životaschopnosti PBMC.Vzorky obarvené AO/PI lze analyzovat pomocí Counstar Rigel
