Abstraktní: Mezenchymální kmenové buňky jsou podskupinou pluripotentních kmenových buněk, které lze izolovat z mezodermu.Díky své obnově sebereplikace a vícesměrné diferenciaci mají vysoký potenciál pro různé terapie v medicíně.Mezenchymální kmenové buňky mají jedinečný imunitní fenotyp a schopnost imunitní regulace.Mezenchymální kmenové buňky jsou proto již široce používány při transplantacích kmenových buněk, tkáňovém inženýrství a transplantacích orgánů.A kromě těchto aplikací se používají jako ideální nástroj v tkáňovém inženýrství jako zárodečné buňky v řadě základních a klinických výzkumných experimentů.Doposud neexistuje široce přijímaná metoda a standard pro kontrolu kvality mezenchymálních kmenových buněk.Countstar Rigel může monitorovat koncentraci, životaschopnost a fenotypové charakteristiky (a jejich změny) během produkce a diferenciace těchto kmenových buněk.Countstar Rigel má také výhodu v získávání dalších morfologických informací, poskytovaných permanentním záznamem obrazu ve světlém poli a fluorescenci během celého procesu monitorování kvality buněk.Countstar Rigel nabízí rychlou, sofistikovanou a spolehlivou metodu kontroly kvality kmenových buněk.
Materiály a metody:
Mezenchymální kmenové buňky odvozené z tukové tkáně (AdMSC) byly darovány profesorem Nianminem Qi, AO/PI barvícím roztokem (Shanghai RuiYu, CF002).Protilátky: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (společnost BD).
AdMSC byly kultivovány ve zvlhčovaném inkubátoru při 37 °C, 5 % CO2.Před použitím štěpte trypsinem.
Postup barvení CD markerů byl dodržen jako manuál protilátky.
Detekce CD markerů pomocí Countstar Rigel:
1. Procedura aplikace signální barvy byla vytvořena nastavením PE kanálu na zobrazení PE fluorescence.
2. Z každé komory byla zachycena 3 pole.
3. Po dokončení zobrazování a počáteční analýzy bylo pomocí softwaru FCS nastaveno nastavení prahu (log gate) pro pozitivní a negativní transfekci.
Kontrola kvality kmenových buněk
Následující obrázek (obrázek 1) ukazuje postup terapie kmenovými buňkami .
Obrázek 1: Postup pro terapii kmenovými buňkami
Výsledek:
Stanovení koncentrace, životaschopnosti, průměru a agregace AdMSC.
Životaschopnost AdMSC byla stanovena pomocí AO/PI. Postup aplikace dvou barev byl vytvořen nastavením zeleného kanálu a červeného kanálu na zobrazení fluorescence AO a PI, plus světlé pole.Příklady obrázků jsou na obrázku 2.
Obrázek 2. Snímky před přepravou a po přepravě AdMSC.A. Před přepravou;je zobrazen reprezentativní obrázek.B. Po přepravě;je zobrazen reprezentativní obrázek.
Životaschopnost AdMSC se po přepravě ve srovnání s před přepravou drasticky změnila.Životaschopnost před přepravou byla 92 %, ale po přepravě se snížila na 71 %.Výsledek byl znázorněn na obrázku 3.
Obrázek 3. Výsledky životaschopnosti AdMSC (před přepravou a po přepravě)
Průměr a agregace byly také určeny Countstar Rigel.Průměr AdMSC se po přepravě drasticky změnil ve srovnání s před přepravou.Průměr před transportem byl 19 um, ale po transportu se zvýšil na 21 um.Agregace před přepravou byla 20 %, ale po přepravě se zvýšila na 25 %.Ze snímků zachycených Countstar Rigelem se fenotyp AdMSC po transportu drasticky změnil.Výsledky jsou znázorněny na obrázku 4.
Obrázek 4: Výsledky průměru a agregace.Odpověď: Reprezentativní obrázky AdMSC, fenotyp AdMSC byly po přepravě drasticky změněny.B: Agregace před přepravou byla 20 %, ale po přepravě se zvýšila na 25 %.C: Průměr před transportem byl 19 um, ale po transportu se zvýšil na 21 um.
Určete imunofenotyp AdMSC pomocí Countstar Rigel
Imunofenotyp AdMSC byl stanoven pomocí Countstar Rigel, AdMSC byly inkubovány s různými protilátkami (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Postup aplikace signální barvy byl vytvořen nastavením zeleného kanálu pro zobrazení fluorescence PE a jasného pole.Referenční segmentace obrazu ve světlém poli byla použita jako maska pro vzorkování PE fluorescenčního signálu.Byly ukázány výsledky CD105 (obrázek 5).
Obrázek 5: CD105 výsledky AdMSC byly stanoveny pomocí Countstar Rigel.A: Kvantitativní analýza pozitivního procenta CD105 v různých vzorcích pomocí softwaru FCS express 5 plus.B: Vysoce kvalitní snímky poskytují další morfologické informace.C: Ověřené výsledky pomocí miniatur každé jednotlivé buňky, softwarové nástroje FCS rozdělily buňky do různých skupin podle jejich různé proteinové exprese.
Další výsledky protilátek jsou uvedeny na Obr
Obrázek 6: A: Reprezentativní snímek ASC s typickou vřetenovitou morfologií.Zachyceno mikroskopem OLYMPUS.Původní zvětšení, (10x).B: Adipogenní diferenciace ASC je doložena barvením rutheniovou červení, které ukazuje oblasti mineralizace.Zachyceno mikroskopem OLYMPUS.Původní zvětšení (10x).C: Countstar FL charakterizace ASC.
Souhrn:
Countstar FL může monitorovat koncentraci, životaschopnost a fenotypové charakteristiky (a jejich změny) během produkce a diferenciace těchto kmenových buněk.FCS express poskytuje funkci pro kontrolu každé signální buňky, ověření dat prostřednictvím obrázku.Uživatel se také může spolehnout na provádění dalších experimentů na základě výsledků Countstar Rigel.Countstar Rigel nabízí rychlou, sofistikovanou a spolehlivou metodu kontroly kvality kmenových buněk.
