Analýza leukocytů v plné krvi je rutinní test v klinické laboratoři nebo krevní bance.Koncentrace a životaschopnost leukocytů jsou vitálním indexem jako kontrola kvality skladování krve.Kromě leukocytů obsahuje plná krev velké množství krevních destiček, červených krvinek nebo buněčných zbytků, které znemožňují analýzu celé krve přímo pod mikroskopem nebo počítačem buněk ve světlém poli.Konvenční metody pro počítání bílých krvinek zahrnují proces lýzy červených krvinek, který je časově náročný.
AOPI Dual-fluoresces counting je typ testu používaný pro detekci buněčné koncentrace a životaschopnosti.Roztok je kombinací akridinové oranže (zeleně fluorescenční barvivo nukleové kyseliny) a propidiumjodidu (červeně fluorescenční barvivo nukleové kyseliny).Propidium jodid (PI) je membránové vylučovací barvivo, které proniká pouze do buněk s narušenými membránami, zatímco akridinová oranž je schopna proniknout do všech buněk v populaci.Pokud jsou v jádře přítomna obě barviva, propidium jodid způsobí snížení fluorescence akridinové oranže přenosem fluorescenční rezonanční energie (FRET).V důsledku toho se buňky s jádry s neporušenými membránami barví fluorescenčně zeleně a jsou počítány jako živé, zatímco buňky s jádry s narušenými membránami se barví pouze fluorescenčně červeně a jsou počítány jako mrtvé při použití systému Countstar® Rigel.
Countstar Rigel je ideálním řešením pro mnoho komplexních analýz charakterizace buněčné populace, které umožňují rychlou analýzu bílých krvinek v plné krvi.
Experimentální procedura:
1. Odeberte 20 µl vzorku krve a nařeďte vzorek ve 180 µl PBS.
2. Přidejte 12 µl roztoku AO/PI do 12 µl vzorku, jemně promíchejte pipetou;
3.Natáhněte 20 ul směsi do komorového sklíčka;
4.Nechte buňky usadit v komoře asi 1 minutu;
5. Nasaďte sklíčko do přístroje Countstar FL;
6. Vyberte test „AO/PI Viability“ a poté zadejte ID vzorku pro tento vzorek.
7. Vyberte Dilution ratio (Poměr ředění), Cell Type (Typ buňky) a kliknutím na 'Run' (Spustit) spusťte test.
Upozornění: AO a PI je potenciální karcinogen.Doporučuje se, aby obsluha nosila osobní ochranné prostředky (OOP), aby se zabránilo přímému kontaktu s kůží a očima.
Výsledek:
1. Světlé pole Obrázek plné krve
Na snímku plné krve ve světlém poli nejsou mezi červenými krvinkami viditelné bílé krvinky.(Obrázek 1)
Obrázek 1 Jasný obraz plné krve.
2. Fluorescenční obraz plné krve
AO a PI barvivo jsou obě skvrny DNA v buněčném jádře buněk.Proto krevní destičky, červené krvinky nebo buněčné zbytky nejsou schopny ovlivnit koncentraci leukocytů a výsledek životaschopnosti.Živé leukocyty (zelená) a mrtvé leukocyty (červená) jsou snadno vizualizovatelné na fluorescenčních snímcích.(Obrázek 2)
Obrázek 2 Fluorescenční snímky plné krve.(A).Obrázek kanálu AO;(B) Obraz kanálu PI;(C) Sloučit obrazy kanálu AO a PI.
3. Koncentrace a životaschopnost leukocytů
Software Countstar FL automaticky počítá buňky ze tří řezů komory a vypočítává průměrnou hodnotu celkového počtu buněk WBC (1202), koncentraci (1,83 x 106 buněk/ml) a % životaschopnosti (82,04 %).Obrázky plné krve a data lze snadno exportovat jako PDF, obrázek nebo Excel pro další analýzu nebo archivaci dat.
Obrázek 3 Snímek obrazovky softwaru Countstar Rigel
