Mae celloedd mononiwclear gwaed ymylol (PBMCs) yn aml yn cael eu prosesu i wahanu oddi wrth waed cyfan trwy allgyrchu graddiant dwysedd.Mae'r celloedd hynny'n cynnwys lymffocytau (celloedd T, celloedd B, celloedd NK) a monocytes, a ddefnyddir yn gyffredin ym maes imiwnoleg, therapi celloedd, clefyd heintus a datblygu brechlyn.Mae monitro a dadansoddi hyfywedd a chrynodiad PBMC yn hanfodol ar gyfer y labordai clinigol, ymchwil gwyddoniaeth feddygol sylfaenol a chynhyrchu celloedd imiwnedd.
Ffig 1. PBMC ynysig o waed ffres gyda centrifugation graddiant Dwysedd
Cyfrif fflworoleuadau deuol AOPI yw'r math o assay a ddefnyddir i ganfod crynodiad celloedd a hyfywedd.Yr ateb yw cyfuniad o acridine oren (y staen asid niwclëig gwyrdd-fflworoleuol) a propidium ïodid (y staen asid niwclëig coch-fflworoleuol).Lliw allgáu pilen yw propidium ïodid (PI) sydd ond yn mynd i mewn i gelloedd â philenni dan fygythiad, tra bod oren acridine yn gallu treiddio i bob cell mewn poblogaeth.Pan fydd y ddau liw yn bresennol yn y cnewyllyn, mae propidium ïodid yn achosi gostyngiad mewn fflworoleuedd oren acridine trwy drosglwyddiad egni cyseiniant fflworoleuedd (FRET).O ganlyniad, mae celloedd cnewyllol â philenni cyfan yn staenio'n wyrdd fflwroleuol ac yn cael eu cyfrif fel rhai byw, tra bod celloedd cnewyllol â philenni dan fygythiad yn staenio coch fflwroleuol yn unig ac yn cael eu cyfrif yn farw wrth ddefnyddio system Countstar® FL.Nid yw deunydd nad yw'n gnewyllol fel celloedd coch y gwaed, platennau a malurion yn fflworoleuol ac maent yn cael eu hanwybyddu gan feddalwedd Countstar® FL.
Gweithdrefn Arbrofol:
1.Dilute y sampl PBMC i 5 crynodiadau gwahanol gyda PBS;
2.Ychwanegu hydoddiant AO/PI 12µl i mewn i sampl 12µl, wedi'i gymysgu'n ysgafn â phibed;
3.Tynnwch gymysgedd 20µl i mewn i sleid siambr;
4.Caniatáu i'r celloedd setlo yn y siambr am tua 1 munud;
5.Trwch y sleid i mewn i offeryn Countstar FL;
6.Dewiswch yr assay “Hyfywedd AO/PI”, yna profwch gan Countstar FL.
Rhybudd: Mae AO a PI yn garsinogen posibl.Argymhellir bod y gweithredwr yn gwisgo offer amddiffynnol personol (PPE) i osgoi cysylltiad uniongyrchol â chroen a llygaid.
Canlyniad:
Delweddau Maes 1.Bright a Fflworoleuedd o'r PBMC
Mae'r llifyn AO a PI yn staeniau DNA yng nghnewyllyn celloedd celloedd.Felly, nid yw Platennau, celloedd gwaed coch, na malurion cellog yn gallu effeithio ar ganlyniad crynodiad a hyfywedd PBMCs.Gellir gwahaniaethu celloedd byw, celloedd marw a malurion yn hawdd ar sail y delweddau a gynhyrchir gan Countstar FL (Ffigur 1).
Ffigur 2.Delweddau Maes Disglair a Fflworoleuedd o'r PBMC
2.Crynodiad a Hyfywedd PBMC
Cafodd samplau PBMC eu gwanhau mewn 2, 4, 8 ac 16 o weithiau gyda PBS, yna deorwyd y samplau hynny â chymysgedd llifyn AO/PI a'u dadansoddi gan Countstar FL yn y drefn honno.Dangosir canlyniad crynodiad a hyfywedd PBMC fel y ffigur isod:
