Abstrakt: Mesenkymale stamceller er en undergruppe af pluripotente stamceller, der kan isoleres fra mesodermen.Med deres fornyelse af selvreplikation og differentieringsegenskaber i flere retninger besidder de et højt potentiale for forskellige terapier inden for medicin.Mesenkymale stamceller har en unik immunfænotype og immunreguleringsevne.Derfor er mesenkymale stamceller allerede meget brugt i stamcelletransplantationer, vævsteknologi og organtransplantation.Og ud over disse applikationer bruges de som et ideelt værktøj i vævsteknologi som såceller i en række grundlæggende og kliniske forskningseksperimenter.Indtil nu er der ikke en bredt accepteret metode og standard for kvalitetskontrol af mesenkymale stamceller.Countstar Rigel kan overvåge koncentrationen, levedygtigheden og fænotypekarakteristika (og deres ændringer) under produktionen og differentieringen af disse stamceller.Countstar Rigel har også fordelen ved at opnå yderligere morfologisk information, leveret af de permanente lysfelt- og fluorescensbaserede billedoptagelser under hele processen med cellekvalitetsovervågning.Countstar Rigel tilbyder en hurtig, sofistikeret og pålidelig metode til kvalitetskontrol af stamceller.
Materialer og metoder:
Adipose-afledte mesenkymale stamceller (AdMSC'er) blev foræret af professor Nianmin Qi, AO/PI-farvningsopløsning (Shanghai RuiYu, CF002).Antistof: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC'er blev dyrket i en 37 ℃, 5% CO2 befugtet inkubator.Fordøj med trypsin før brug.
CD-markør-farvningsprocedure blev fulgt som manualen for antistof.
CD-markørdetektion med Countstar Rigel:
1. En signal-farve-påføringsprocedure blev oprettet ved at indstille PE-kanalen til billed-PE-fluorescens.
2. 3 felter blev fanget fra hvert kammer.
3. Efter billeddannelse og indledende analyse var afsluttet, blev tærskelværdien (log gate) indstillingen for positiv og negativ transfektion indstillet af FCS-software.
Kvalitetskontrol af stamceller
Den følgende figur (figur 1) viser proceduren for stamcelleterapi .
Figur 1: Fremgangsmåden for stamcelleterapi
Resultater:
Bestemmelse af koncentration, levedygtighed, diameter og aggregering af AdMSC'er.
Levedygtigheden af AdMSC'er blev bestemt af AO/PI. En dobbeltfarvet påføringsprocedure blev oprettet ved at indstille Grøn kanal og Rød kanal til at afbilde AO- og PI-fluorescens plus et lyst felt.Eksempelbilleder blev vist i figur 2.
Figur 2. Billeder af før transport og efter transport af AdMSC'er.A. Før transport;der vises et repræsentativt billede.B. Efter transport;der vises et repræsentativt billede.
Levedygtigheden af AdMSC'er blev ændret drastisk efter transport sammenlignet med før transport.Levedygtigheden før transport var 92%, men den reducerede til 71% efter transport.Resultatet er vist i figur 3.
Figur 3. Levedygtighedsresultaterne for AdMSC'er (før transport og efter transport)
Diameteren og aggregeringen blev også bestemt af Countstar Rigel.Diameteren af AdMSC'er blev ændret drastisk efter transport sammenlignet med før transport.Diameteren før transport var 19 µm, men den steg til 21 µm efter transport.Aggregeringen af før transport var 20%, men den steg til 25% efter transport.Fra billederne taget af Countstar Rigel blev fænotypen af AdMSC'er ændret drastisk efter transport.Resultaterne er vist i figur 4.
Figur 4: Diameter og aggregeringsresultater.A: De repræsentative billeder af AdMSC'er, fænotypen af AdMSC'er, blev ændret drastisk efter transport.B: Sammenlægningen før transport var 20 %, men den steg til 25 % efter transport.C: Diameteren før transport var 19 µm, men den steg til 21 µm efter transport.
Bestem immunfænotypen af AdMSC'er af Countstar Rigel
Immunfænotypen af AdMSC'er blev bestemt af Countstar Rigel, AdMSC'er blev inkuberet med henholdsvis forskellige antistoffer (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).En signal-farve-applikationsprocedure blev oprettet ved at indstille en grøn kanal til at afbilde PE-fluorescens plus et lyst felt.Bright field billedreferencesegmentering blev anvendt som en maske til at prøve PE-fluorescenssignalet.Resultaterne af CD105 blev vist (figur 5).
Figur 5: CD105-resultater af AdMSC'er blev bestemt af Countstar Rigel.A: Kvantitativ analyse af den positive procentdel af CD105 i forskellige prøver med FCS express 5 plus software.B: Billeder af høj kvalitet giver yderligere morfologisk information.C: Validerede resultater af thumbnails af hver enkelt celle, FCS-softwareværktøjerne opdelte cellerne i forskellige grupper i henhold til deres varierende proteinekspression.
Andre antistofresultater blev vist i fig. 6
Figur 6: A: Et repræsentativt billede af ASC'er med typisk spindelformet morfologi.Fanget med OLYMPUS mikroskop.Original forstørrelse, (10x).B: Adipogen differentiering af ASC'er er dokumenteret ved rutheniumrød farvning, der viser områder med mineralisering.Fanget med OLYMPUS mikroskop.Original forstørrelse (10x).C: Countstar FL karakterisering af ASC'er.
Resumé:
Countstar FL kan overvåge koncentrationen, levedygtigheden og fænotypekarakteristika (og deres ændringer) under produktionen og differentieringen af disse stamceller.FCS express leverer funktionen til at gennemgå hver signalcelle, validere dataene gennem billedet.Brugeren kan også have tillid til at udføre de næste eksperimenter baseret på Countstar Rigel-resultater.Countstar Rigel tilbyder en hurtig, sofistikeret og pålidelig metode til kvalitetskontrol af stamceller.
