Perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) behandles ofte for at adskilles fra fuldblod ved tæthedsgradientcentrifugering.Disse celler består af lymfocytter (T-celler, B-celler, NK-celler) og monocytter, der almindeligvis anvendes inden for immunologi, celleterapi, infektionssygdomme og vaccineudvikling.Overvågning og analyse af levedygtighed og koncentration af PBMC er afgørende for de kliniske laboratorier, grundlæggende medicinsk videnskabelig forskning og immuncelleproduktion.
Fig. 1. Isoleret PBMC fra frisk blod med densitetsgradientcentrifugering
AOPI Dual-fluoresces-tælling er den analysetype, der bruges til at detektere cellekoncentration og levedygtighed.Opløsningen er en kombination af acridinorange (den grøn-fluorescerende nukleinsyrefarve) og propidiumiodid (den rød-fluorescerende nukleinsyrefarve).Propidiumiodid (PI) er et membranudelukkende farvestof, der kun trænger ind i celler med kompromitterede membraner, mens acridin orange er i stand til at trænge ind i alle celler i en population.Når begge farvestoffer er til stede i kernen, forårsager propidiumiodid en reduktion i acridinorange fluorescens ved fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).Som et resultat heraf farves nukleerede celler med intakte membraner fluorescerende grønne og tælles som levende, hvorimod nukleerede celler med kompromitterede membraner kun farves fluorescerende røde og tælles som døde, når Countstar® FL-systemet bruges.Ikke-kerneholdigt materiale såsom røde blodlegemer, blodplader og affald fluorescerer ikke og ignoreres af Countstar® FL-softwaren.
Eksperimentel procedure:
1. Fortynd PBMC-prøven i 5 forskellige koncentrationer med PBS;
2. Tilsæt 12 µl AO/PI-opløsning til 12 µl prøve, forsigtigt blandet med pipette;
3. Træk 20 µl blanding ind i kammerobjektglasset;
4. Lad cellerne sætte sig i kammeret i ca. 1 minut;
5. Insektion af objektglasset i Countstar FL-instrumentet;
6. Vælg "AO/PI Viability"-analysen, og test derefter med Countstar FL.
Forsigtig: AO og PI er et potentielt kræftfremkaldende stof.Det anbefales, at operatøren bærer personlige værnemidler (PPE) for at undgå direkte kontakt med hud og øjne.
Resultat:
1.Bright Field og Fluorescens billeder af PBMC
AO- og PI-farvestoffet er begge farver DNA i cellekernen af celler.Derfor er blodplader, røde blodlegemer eller celleaffald ikke i stand til at påvirke PBMCs koncentration og levedygtighedsresultat.Levende celler, døde celler og affald kan let skelnes på baggrund af billederne genereret af Countstar FL (figur 1).
Figur 2．Bright Field og Fluorescens billeder af PBMC
2. Koncentration og levedygtighed af PBMC
PBMC-prøverne blev fortyndet 2, 4, 8 og 16 gange med PBS, hvorefter disse prøver blev inkuberet med en AO/PI-farveblanding og analyseret af henholdsvis Countstar FL.Resultatet af koncentration og levedygtighed af PBMC er vist som nedenstående figur:
