Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden häufig verarbeitet, um sie durch Dichtegradientenzentrifugation von Vollblut zu trennen.Diese Zellen bestehen aus Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen) und Monozyten, die üblicherweise auf dem Gebiet der Immunologie, Zelltherapie, Infektionskrankheiten und Impfstoffentwicklung verwendet werden.Die Überwachung und Analyse der Lebensfähigkeit und Konzentration von PBMC ist entscheidend für die klinischen Labors, die medizinische Grundlagenforschung und die Produktion von Immunzellen.
Abb. 1. Isolierte PBMC aus frischem Blut mit Dichtegradientenzentrifugation
AOPI-Dual-Fluoreszenz-Zählung ist der Assay-Typ, der zum Nachweis von Zellkonzentration und Lebensfähigkeit verwendet wird.Die Lösung ist eine Kombination aus Acridinorange (der grün fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoff) und Propidiumiodid (der rot fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoff).Propidiumiodid (PI) ist ein Membranausschlussfarbstoff, der nur in Zellen mit beschädigten Membranen eindringt, während Acridinorange in alle Zellen einer Population eindringen kann.Wenn beide Farbstoffe im Zellkern vorhanden sind, bewirkt Propidiumiodid eine Verringerung der Acridinorange-Fluoreszenz durch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET).Infolgedessen färben sich kernhaltige Zellen mit intakten Membranen fluoreszierend grün und werden als lebend gezählt, während kernhaltige Zellen mit beschädigten Membranen nur fluoreszierend rot gefärbt und bei Verwendung des Countstar® FL-Systems als tot gezählt werden.Nicht kernhaltiges Material wie rote Blutkörperchen, Blutplättchen und Zelltrümmer fluoreszieren nicht und werden von der Countstar® FL-Software ignoriert.
Versuchsdurchführung:
1.Verdünnen Sie die PBMC-Probe in 5 verschiedenen Konzentrationen mit PBS;
2. Geben Sie 12 µl AO/PI-Lösung in 12 µl Probe und mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette;
3. 20 µl Mischung in den Kammerobjektträger ziehen;
4. Lassen Sie die Zellen ca. 1 Minute in der Kammer absetzen;
5. Setzen Sie den Objektträger in das Countstar FL-Instrument ein;
6. Wählen Sie den Assay „AO/PI Viability“ und testen Sie ihn dann mit Countstar FL.
Achtung: AO und PI sind potenziell karzinogen.Es wird empfohlen, dass der Bediener persönliche Schutzausrüstung (PSA) trägt, um direkten Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden.
Ergebnis:
1. Hellfeld- und Fluoreszenzbilder des PBMC
Der AO- und der PI-Farbstoff färben beide DNA im Zellkern von Zellen.Daher können Blutplättchen, rote Blutkörperchen oder Zelltrümmer die PBMC-Konzentration und das Ergebnis der Lebensfähigkeit nicht beeinflussen.Lebende Zellen, tote Zellen und Trümmer können anhand der von Countstar FL erzeugten Bilder leicht unterschieden werden (Abbildung 1).
Abbildung 2．Hellfeld- und Fluoreszenzbilder des PBMC
2.Konzentration und Lebensfähigkeit von PBMC
Die PBMC-Proben wurden 2-, 4-, 8- und 16-fach mit PBS verdünnt, dann wurden diese Proben mit einer AO/PI-Farbstoffmischung inkubiert und jeweils mit Countstar FL analysiert.Das Ergebnis der Konzentration und Lebensfähigkeit von PBMC ist in der folgenden Abbildung dargestellt:
