Die Analyse der Leukozyten im Vollblut ist ein Routinetest im klinischen Labor oder in der Blutbank.Die Konzentration und Lebensfähigkeit der Leukozyten sind der entscheidende Index als Qualitätskontrolle der Blutlagerung.Abgesehen von Leukozyten enthält Vollblut eine große Anzahl von Blutplättchen, roten Blutkörperchen oder Zelltrümmern, die es unmöglich machen, Vollblut direkt unter dem Mikroskop oder Hellfeld-Zellzähler zu analysieren.Herkömmliche Methoden zum Zählen weißer Blutkörperchen beinhalten einen RBC-Lyseprozess, der zeitaufwändig ist.
AOPI-Dual-Fluoreszenz-Zählung ist der Assay-Typ, der zum Nachweis von Zellkonzentration und Lebensfähigkeit verwendet wird.Die Lösung ist eine Kombination aus Acridinorange (der grün fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoff) und Propidiumiodid (der rot fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoff).Propidiumiodid (PI) ist ein Membranausschlussfarbstoff, der nur in Zellen mit beschädigten Membranen eindringt, während Acridinorange in alle Zellen einer Population eindringen kann.Wenn beide Farbstoffe im Zellkern vorhanden sind, bewirkt Propidiumiodid eine Verringerung der Acridinorange-Fluoreszenz durch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET).Infolgedessen färben sich kernhaltige Zellen mit intakten Membranen fluoreszierend grün und werden als lebend gezählt, während kernhaltige Zellen mit beschädigten Membranen nur fluoreszierend rot gefärbt und bei Verwendung des Countstar® Rigel-Systems als tot gezählt werden.
Countstar Rigel ist eine ideale Lösung für viele komplexe Assays zur Charakterisierung von Zellpopulationen, die eine schnelle Analyse weißer Blutkörperchen in Vollblut ermöglichen.
Versuchsdurchführung:
1. Nehmen Sie 20 µl Blutprobe und verdünnen Sie die Probe in 180 µl PBS.
2. Geben Sie 12 µl AO/PI-Lösung in 12 µl Probe und mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette;
3. 20 µl Mischung in den Kammerobjektträger ziehen;
4. Lassen Sie die Zellen ca. 1 Minute in der Kammer absetzen;
5. Setzen Sie den Objektträger in das Countstar FL-Instrument ein;
6. Wählen Sie den Assay „AO/PI Viability“ und geben Sie dann die Proben-ID für diese Probe ein.
7. Wählen Sie das Verdünnungsverhältnis, den Zelltyp und klicken Sie auf „Ausführen“, um den Test zu starten.
Achtung: AO und PI sind potenziell karzinogen.Es wird empfohlen, dass der Bediener persönliche Schutzausrüstung (PSA) trägt, um direkten Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden.
Ergebnis:
1. Hellfeldbild von Vollblut
Im Hellfeldbild des Vollbluts sind WBCs zwischen den roten Blutkörperchen nicht sichtbar.(Abbildung 1)
Abbildung 1 Hellfeldbild von Vollblut.
2. Fluoreszenzbild von Vollblut
Der AO- und der PI-Farbstoff färben beide DNA im Zellkern von Zellen.Daher sind Blutplättchen, rote Blutkörperchen oder Zelltrümmer nicht in der Lage, die Leukozytenkonzentration und das Ergebnis der Lebensfähigkeit zu beeinflussen.Lebende Leukozyten (grün) und tote Leukozyten (rot) sind in den Fluoreszenzbildern gut sichtbar.(Figur 2)
Abbildung 2 Fluoreszenzbilder von Vollblut.(EIN).Bild des AO-Kanals;(B) Bild des PI-Kanals;(C) Bilder von AO- und PI-Kanal zusammenführen.
3. Konzentration und Lebensfähigkeit von Leukozyten
Die Countstar FL-Software zählt automatisch die Zellen von drei Kammerabschnitten und berechnet den Durchschnittswert der gesamten WBC-Zellzahl (1202), der Konzentration (1,83 x 106 Zellen/ml) und der prozentualen Lebensfähigkeit (82,04 %).Die Vollblutbilder und -daten können zur zusätzlichen Analyse oder Datenarchivierung einfach als PDF, Bild oder Excel exportiert werden.
Abbildung 3 Screenshot der Countstar Rigel Software
