Αφηρημένη: Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα είναι ένα υποσύνολο πολυδύναμων βλαστοκυττάρων που μπορούν να απομονωθούν από το μεσόδερμα.Με τα χαρακτηριστικά ανανέωσης αυτοαντιγραφής και διαφοροποίησης πολλαπλών κατευθύνσεων, διαθέτουν υψηλές δυνατότητες για διάφορες θεραπείες στην ιατρική.Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα έχουν μοναδικό ανοσοποιητικό φαινότυπο και ικανότητα ανοσορύθμισης.Ως εκ τούτου, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα χρησιμοποιούνται ήδη ευρέως σε μεταμοσχεύσεις βλαστοκυττάρων, μηχανική ιστών και μεταμόσχευση οργάνων.Και πέρα από αυτές τις εφαρμογές, χρησιμοποιούνται ως ιδανικό εργαλείο στη μηχανική ιστών ως κύτταρα σποράς σε μια σειρά βασικών και κλινικών ερευνητικών πειραμάτων.Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχει ευρέως αποδεκτή μέθοδος και πρότυπο για τον ποιοτικό έλεγχο των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων.Το Countstar Rigel μπορεί να παρακολουθεί τη συγκέντρωση, τη βιωσιμότητα και τα χαρακτηριστικά φαινοτύπου (και τις αλλαγές τους) κατά την παραγωγή και τη διαφοροποίηση αυτών των βλαστοκυττάρων.Το Countstar Rigel έχει επίσης το πλεονέκτημα στη λήψη πρόσθετων μορφολογικών πληροφοριών, που παρέχονται από τις μόνιμες εγγραφές εικόνων φωτεινού πεδίου και φθορισμού κατά τη διάρκεια όλης της διαδικασίας παρακολούθησης της ποιότητας των κυττάρων.Το Countstar Rigel προσφέρει μια γρήγορη, εξελιγμένη και αξιόπιστη μέθοδο για τον ποιοτικό έλεγχο των βλαστοκυττάρων.
Υλικά και μέθοδοι:
Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που προέρχονται από λιπώδη ιστό (AdMSCs) δόθηκαν από τον καθηγητή Nianmin Qi, διάλυμα χρώσης AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Αντίσωμα: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
Τα AdMSC καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα υγροποιημένου 37℃, 5% CO2.Πέψη με θρυψίνη πριν από τη χρήση.
Η διαδικασία χρώσης με δείκτη CD ακολουθήθηκε ως το εγχειρίδιο του αντισώματος.
Ανίχνευση δείκτη CD με το Countstar Rigel:
1. Δημιουργήθηκε μια διαδικασία εφαρμογής χρώματος σήματος ρυθμίζοντας το κανάλι PE ώστε να απεικονίζει φθορισμό PE.
2. Από κάθε θάλαμο συλλήφθηκαν 3 χωράφια.
3. Μετά την ολοκλήρωση της απεικόνισης και της αρχικής ανάλυσης, η ρύθμιση κατωφλίου (log gate) για θετική και αρνητική επιμόλυνση ορίστηκε από το λογισμικό FCS.
Ποιοτικός έλεγχος βλαστοκυττάρων
Το παρακάτω σχήμα (Εικόνα 1) δείχνει τη διαδικασία του θεραπεία με βλαστοκύτταρα .
Εικόνα 1: Η διαδικασία για τη θεραπεία με βλαστοκύτταρα
Αποτελέσματα:
Προσδιορισμός της συγκέντρωσης, της βιωσιμότητας, της διαμέτρου και της συσσώρευσης των AdMSC.
Η βιωσιμότητα των AdMSC προσδιορίστηκε από το AO/PI. Δημιουργήθηκε μια διαδικασία εφαρμογής διπλού χρώματος ρυθμίζοντας το Πράσινο κανάλι και το Κόκκινο κανάλι στην εικόνα φθορισμού AO και PI, συν ένα φωτεινό πεδίο.Παραδείγματα εικόνων φαίνονται στο Σχήμα 2.
Εικόνα 2. Εικόνες πριν από τη μεταφορά και μετά τη μεταφορά των AdMSC.Α. Πριν από τη μεταφορά.εμφανίζεται μια αντιπροσωπευτική εικόνα.Β. Μετά τη μεταφορά.εμφανίζεται μια αντιπροσωπευτική εικόνα.
Η βιωσιμότητα των AdMSC άλλαξε δραστικά μετά τη μεταφορά σε σύγκριση με πριν από τη μεταφορά.Η βιωσιμότητα πριν από τη μεταφορά ήταν 92%, αλλά μειώθηκε στο 71% μετά τη μεταφορά.Το αποτέλεσμα φαίνεται στο Σχήμα 3.
Εικόνα 3. Τα αποτελέσματα βιωσιμότητας των AdMSC (Πριν από τη μεταφορά και μετά τη μεταφορά)
Η διάμετρος και η συσσωμάτωση καθορίστηκαν επίσης από τον Countstar Rigel.Η διάμετρος των AdMSC άλλαξε δραστικά μετά τη μεταφορά σε σύγκριση με πριν από τη μεταφορά.Η διάμετρος πριν από τη μεταφορά ήταν 19 μm, αλλά αυξήθηκε στα 21 μm μετά τη μεταφορά.Η συγκέντρωση πριν από τη μεταφορά ήταν 20%, αλλά αυξήθηκε σε 25% μετά τη μεταφορά.Από τις εικόνες που τραβήχτηκαν από τον Countstar Rigel, ο φαινότυπος των AdMSC άλλαξε δραστικά μετά τη μεταφορά.Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4.
Εικόνα 4: Η διάμετρος και τα αποτελέσματα συσσωμάτωσης.Α: Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των AdMSC, ο φαινότυπος των AdMSC άλλαξαν δραστικά μετά τη μεταφορά.Β: Η συγκέντρωση πριν από τη μεταφορά ήταν 20%, αλλά αυξήθηκε σε 25% μετά τη μεταφορά.Γ: Η διάμετρος πριν από τη μεταφορά ήταν 19 μm, αλλά αυξήθηκε στα 21 μm μετά τη μεταφορά.
Προσδιορίστε τον ανοσοφαινότυπο των AdMSCs από τον Countstar Rigel
Ο ανοσοφαινότυπος των AdMSC προσδιορίστηκε με Countstar Rigel, τα AdMSC επωάστηκαν με διαφορετικό αντίσωμα αντίστοιχα (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Δημιουργήθηκε μια διαδικασία εφαρμογής χρώματος σήματος με τη ρύθμιση ενός καναλιού πράσινου για την απεικόνιση του φθορισμού PE, συν ένα φωτεινό πεδίο.Η τμηματοποίηση αναφοράς εικόνας φωτεινού πεδίου εφαρμόστηκε ως μάσκα για τη δειγματοληψία του σήματος φθορισμού PE.Τα αποτελέσματα του CD105 παρουσιάστηκαν (Εικόνα 5).
Εικόνα 5: Τα αποτελέσματα CD105 των AdMSC προσδιορίστηκαν από τον Countstar Rigel.Α: Ποσοτική ανάλυση του θετικού ποσοστού CD105 σε διαφορετικά δείγματα με λογισμικό FCS express 5 plus.Β: Οι εικόνες υψηλής ποιότητας παρέχουν πρόσθετες μορφολογικές πληροφορίες.Γ: Επικυρωμένα αποτελέσματα με μικρογραφίες κάθε μεμονωμένου κυττάρου, τα εργαλεία λογισμικού FCS χώρισαν τα κύτταρα σε διαφορετικές ομάδες ανάλογα με τη διαφορετική έκφραση πρωτεΐνης τους.
Άλλα αποτελέσματα αντισωμάτων φαίνονται στο Σχήμα 6
Εικόνα 6: Α: Αντιπροσωπευτική εικόνα ASC με τυπική ατρακτοειδή μορφολογία.Καταγράφηκε με μικροσκόπιο OLYMPUS.Αρχική μεγέθυνση, (10x).Β: Η λιπογενής διαφοροποίηση των ASCs αποδεικνύεται από τη χρώση με ερυθρό ρουθηνίου που δείχνει περιοχές ανοργανοποίησης.Καταγράφηκε με μικροσκόπιο OLYMPUS.Αρχική μεγέθυνση (10x).C: Countstar FL χαρακτηρισμός των ASC.
Περίληψη:
Το Countstar FL μπορεί να παρακολουθεί τη συγκέντρωση, τη βιωσιμότητα και τα χαρακτηριστικά φαινοτύπου (και τις αλλαγές τους) κατά την παραγωγή και τη διαφοροποίηση αυτών των βλαστοκυττάρων.Το FCS express παρέχει τη λειτουργία ελέγχου κάθε κυψέλης σήματος, επικύρωσης των δεδομένων μέσω της εικόνας.Ο χρήστης μπορεί επίσης να έχει τη σιγουριά να πραγματοποιήσει τα επόμενα πειράματα με βάση τα αποτελέσματα του Countstar Rigel.Το Countstar Rigel προσφέρει μια γρήγορη, εξελιγμένη και αξιόπιστη μέθοδο για τον ποιοτικό έλεγχο των βλαστοκυττάρων.
