Τα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) συχνά υποβάλλονται σε επεξεργασία για να διαχωριστούν από το πλήρες αίμα με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας.Αυτά τα κύτταρα αποτελούνται από λεμφοκύτταρα (Τ κύτταρα, Β κύτταρα, ΝΚ κύτταρα) και μονοκύτταρα, που χρησιμοποιούνται συνήθως στον τομέα της ανοσολογίας, της κυτταρικής θεραπείας, των μολυσματικών ασθενειών και της ανάπτυξης εμβολίων.Η παρακολούθηση και η ανάλυση της βιωσιμότητας και της συγκέντρωσης των PBMC είναι ζωτικής σημασίας για τα κλινικά εργαστήρια, την έρευνα της βασικής ιατρικής επιστήμης και την παραγωγή ανοσοκυττάρων.
Σχήμα 1. Απομονωμένο PBMC από φρέσκο αίμα με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας
Η μέτρηση διπλού φθορισμού AOPI είναι ο τύπος ανάλυσης που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της συγκέντρωσης και της βιωσιμότητας των κυττάρων.Το διάλυμα είναι συνδυασμός πορτοκαλί ακριδίνης (η χρώση με πράσινο φθορίζον νουκλεϊκό οξύ) και ιωδιούχο προπίδιο (κόκκινο φθορίζον νουκλεϊκό οξύ).Το ιωδιούχο προπίδιο (PI) είναι μια χρωστική αποκλεισμού μεμβράνης που εισέρχεται μόνο σε κύτταρα με υποβαθμισμένες μεμβράνες, ενώ το πορτοκαλί ακριδίνης είναι σε θέση να διεισδύσει σε όλα τα κύτταρα ενός πληθυσμού.Όταν υπάρχουν και οι δύο χρωστικές στον πυρήνα, το ιωδιούχο προπίδιο προκαλεί μείωση του φθορισμού πορτοκαλί ακριδίνης μέσω μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET).Ως αποτέλεσμα, τα πυρηνωμένα κύτταρα με άθικτες μεμβράνες χρωματίζουν το φθορίζον πράσινο και υπολογίζονται ως ζωντανά, ενώ τα πυρηνωμένα κύτταρα με υποβαθμισμένες μεμβράνες χρωματίζουν μόνο το φθορίζον κόκκινο και υπολογίζονται ως νεκρά όταν χρησιμοποιείται το σύστημα Countstar® FL.Μη πυρηνοποιημένο υλικό όπως ερυθρά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια και υπολείμματα δεν φθορίζουν και αγνοούνται από το λογισμικό Countstar® FL.
Πειραματική διαδικασία:
1. Αραιώστε το δείγμα PBMC σε 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις με PBS.
2. Προσθέστε 12 μl διαλύματος AO/PI σε δείγμα 12 μl, αναμεμειγμένο απαλά με πιπέτα.
3. Τραβήξτε 20 μl μείγματος στην αντικειμενοφόρο πλάκα του θαλάμου.
4. Αφήστε τα κύτταρα να εγκατασταθούν στο θάλαμο για περίπου 1 λεπτό.
5. Τοποθετήστε τη διαφάνεια στο όργανο Countstar FL.
6.Επιλέξτε την ανάλυση «AO/PI Viability» και μετά δοκιμάστε από το Countstar FL.
Προσοχή: Το AO και το PI είναι πιθανό καρκινογόνο.Συνιστάται ο χειριστής να φοράει ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό (ΜΑΠ) για να αποφύγει την άμεση επαφή με το δέρμα και τα μάτια.
Αποτέλεσμα:
1.Εικόνες φωτεινού πεδίου και φθορισμού του PBMC
Η χρωστική AO και PI είναι και οι δύο κηλίδες DNA στον κυτταρικό πυρήνα των κυττάρων.Επομένως, τα αιμοπετάλια, τα ερυθρά αιμοσφαίρια ή τα κυτταρικά υπολείμματα δεν μπορούν να επηρεάσουν τη συγκέντρωση των PBMC και το αποτέλεσμα βιωσιμότητας.Τα ζωντανά κύτταρα, τα νεκρά κύτταρα και τα υπολείμματα μπορούν εύκολα να διακριθούν με βάση τις εικόνες που δημιουργούνται από το Countstar FL (Εικόνα 1).
Εικόνα 2.Εικόνες φωτεινού πεδίου και φθορισμού του PBMC
2.Συγκέντρωση και βιωσιμότητα του PBMC
Τα δείγματα PBMC αραιώθηκαν σε 2, 4, 8 και 16 φορές με PBS, στη συνέχεια αυτά τα δείγματα επωάστηκαν με ένα μίγμα βαφής AO/PI και αναλύθηκαν με Countstar FL αντίστοιχα.Το αποτέλεσμα της συγκέντρωσης και της βιωσιμότητας του PBMC φαίνεται στο παρακάτω σχήμα:
