Resumen: Las células madre mesenquimales son un subconjunto de células madre pluripotentes que se pueden aislar del mesodermo.Con sus características de renovación de autorreplicación y diferenciación multidireccional, poseen un alto potencial para diversas terapias en medicina.Las células madre mesenquimales tienen un fenotipo inmunitario único y una capacidad de regulación inmunitaria.Por lo tanto, las células madre mesenquimales ya se utilizan ampliamente en trasplantes de células madre, ingeniería de tejidos y trasplante de órganos.Y más allá de estas aplicaciones, se utilizan como una herramienta ideal en la ingeniería de tejidos como células sembradoras en una serie de experimentos de investigación básicos y clínicos.Hasta el momento, no existe un método y estándar ampliamente aceptado para el control de calidad de las células madre mesenquimales.El puede monitorear las características de concentración, viabilidad y fenotipo (y sus cambios) durante la producción y diferenciación de estas células madre.El también tiene la ventaja de obtener información morfológica adicional, proporcionada por las grabaciones permanentes de imágenes de campo claro y basadas en fluorescencia durante todo el proceso de monitoreo de la calidad celular. ofrece un método rápido, sofisticado y confiable para el control de calidad de las células madre.
Materiales y métodos:
Las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AdMSC) fueron obsequiadas por el profesor Nianmin Qi, solución de tinción AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Anticuerpo: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (empresa BD).
Las AdMSC se cultivaron en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 a 37 ℃.Digerir con tripsina antes de usar.
El procedimiento de tinción del marcador CD se siguió como el manual del anticuerpo.
Detección de marcador de CD con Countstar Rigel :
1. Se creó un procedimiento de aplicación del color de la señal configurando el canal PE para generar imágenes de fluorescencia PE.
2. Se capturaron 3 campos de cada cámara.
3. Después de que se completaron la formación de imágenes y el análisis inicial, el software FCS estableció la configuración del umbral (puerta de registro) para la transfección positiva y negativa.
Control de calidad de células madre
La siguiente Figura (Figura 1) muestra el procedimiento de terapia con células madre .
Figura 1: El procedimiento para la terapia con células madre
Resultados:
Determinación de la concentración, viabilidad, diámetro y agregación de AdMSC.
La viabilidad de las AdMSC se determinó mediante AO/PI. Se creó un procedimiento de aplicación de dos colores configurando el canal verde y el canal rojo para obtener imágenes de fluorescencia AO y PI, además de un campo brillante.Las imágenes de ejemplo se muestran en la Figura 2.
Figura 2. Imágenes de antes y después del transporte de AdMSC.A. Antes del transporte;se muestra una imagen representativa.B. Después del transporte;se muestra una imagen representativa.
La viabilidad de los AdMSC cambió drásticamente después del transporte en comparación con antes del transporte.La viabilidad antes del transporte era del 92%, pero se redujo al 71% después del transporte.El resultado se mostró en la Figura 3.
Figura 3. Los resultados de viabilidad de los AdMSC (antes del transporte y después del transporte)
El diámetro y la agregación también fueron determinados por .El diámetro de las AdMSC cambió drásticamente después del transporte en comparación con antes del transporte.El diámetro antes del transporte era de 19 µm, pero aumentó a 21 µm después del transporte.La agregación de antes del transporte fue del 20%, pero aumentó al 25% después del transporte.A partir de las imágenes capturadas por , el fenotipo de AdMSC cambió drásticamente después del transporte.Los resultados se muestran en la Figura 4.
Figura 4: Los resultados de diámetro y agregación.R: Las imágenes representativas de AdMSC, el fenotipo de AdMSC cambió drásticamente después del transporte.B: La agregación antes del transporte era del 20%, pero aumentó al 25% después del transporte.C: El diámetro antes del transporte era de 19 µm, pero aumentó a 21 µm después del transporte.
Determinar el inmunofenotipo de AdMSC por Countstar Rigel
determinó el inmunofenotipo de las AdMSC, las AdMSC se incubaron con diferentes anticuerpos respectivamente (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Se creó un procedimiento de aplicación de color de señal configurando un canal verde para obtener imágenes de fluorescencia PE, además de un campo brillante.La segmentación de referencia de imagen de campo claro se aplicó como una máscara para muestrear la señal de fluorescencia de PE.Se mostraron los resultados de CD105 (Figura 5).
Figura 5: Countstar Rigel determinó los resultados de CD105 de .A: Análisis cuantitativo del porcentaje positivo de CD105 en diferentes muestras mediante el software FCS express 5 plus.B: las imágenes de alta calidad proporcionan información morfológica adicional.C: resultados validados por miniaturas de cada célula individual, las herramientas de software FCS dividieron las células en diferentes grupos según su expresión proteica variable.
Otros resultados de anticuerpos se muestran en la Fig. 6
Figura 6: A: una imagen representativa de ASC con morfología típica en forma de huso.Capturado por el microscopio OLYMPUS.Ampliación original, (10x).B: La diferenciación adipogénica de las ASC se evidencia mediante la tinción con rojo de rutenio que muestra áreas de mineralización.Capturado por el microscopio OLYMPUS.Ampliación original (10x).C: FL de ASC.
Resumen:
El Countstar FL puede monitorear las características de concentración, viabilidad y fenotipo (y sus cambios) durante la producción y diferenciación de estas células madre.FCS express proporciona la función para revisar cada celda de señal, validar los datos a través de la imagen.El usuario también puede tener la confianza para llevar a cabo los próximos experimentos basados en los resultados de . ofrece un método rápido, sofisticado y confiable para el control de calidad de las células madre.
