Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a menudo se procesan para separarlas de la sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad.Esas células están formadas por linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos, comúnmente utilizadas en el campo de la inmunología, la terapia celular, las enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas.Monitorear y analizar la viabilidad y la concentración de PBMC es crucial para los laboratorios clínicos, la investigación científica médica básica y la producción de células inmunitarias.
Fig. 1. PBMC aisladas de sangre fresca con centrifugación en gradiente de densidad
El recuento de fluorescencia dual de AOPI es el tipo de ensayo utilizado para detectar la concentración y la viabilidad de las células.La solución es una combinación de naranja de acridina (la tinción de ácido nucleico verde fluorescente) y yoduro de propidio (la tinción de ácido nucleico rojo fluorescente).El yoduro de propidio (PI) es un tinte de exclusión de membrana que solo ingresa a las células con membranas comprometidas, mientras que el naranja de acridina puede penetrar en todas las células de una población.Cuando ambos colorantes están presentes en el núcleo, el yoduro de propidio provoca una reducción de la fluorescencia naranja de acridina por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).Como resultado, las células nucleadas con membranas intactas se tiñen de verde fluorescente y se cuentan como vivas, mientras que las células nucleadas con membranas comprometidas solo se tiñen de rojo fluorescente y se cuentan como muertas cuando se usa el sistema ® FL.El material no nucleado, como los glóbulos rojos, las plaquetas y los desechos, no emite fluorescencia y el software ® FL los ignora.
Procedimiento experimental:
1. Diluya la muestra de PBMC en 5 concentraciones diferentes con PBS;
2. Agregue 12 µl de solución de AO/PI a 12 µl de muestra, mezcle suavemente con una pipeta;
3. Extraiga 20 µl de la mezcla en el portaobjetos de la cámara;
4. Permita que las células se asienten en la cámara durante aproximadamente 1 minuto;
5. Inserte el portaobjetos en el instrumento Countstar FL;
6. Elija el ensayo "Viabilidad AO/PI", luego realice la prueba con Countstar FL.
Precaución: AO y PI son carcinógenos potenciales.Se recomienda que el operador use equipo de protección personal (EPP) para evitar el contacto directo con la piel y los ojos.
Resultado:
1. Imágenes de campo brillante y fluorescencia del PBMC
Los colorantes AO y PI tiñen el ADN en el núcleo celular de las células.Por lo tanto, las plaquetas, los glóbulos rojos o los desechos celulares no pueden afectar la concentración de PBMC y el resultado de viabilidad.Las células vivas, las células muertas y los desechos se pueden distinguir fácilmente en base a las imágenes generadas por FL (Figura 1).
Figura 2. Imágenes de campo brillante y fluorescencia del PBMC
2.Concentración y Viabilidad de PBMC
Las muestras de PBMC se diluyeron 2, 4, 8 y 16 veces con PBS, luego esas muestras se incubaron con una mezcla de colorantes AO/PI y se analizaron con FL respectivamente.El resultado de la concentración y viabilidad de PBMC se muestra en la siguiente figura:
