Abstraktne: Mesenhümaalsed tüvirakud on pluripotentsete tüvirakkude alamhulk, mida saab mesodermist eraldada.Oma isereplikatsiooni uuenemise ja mitmesuunaliste diferentseerumisomaduste tõttu on neil suur potentsiaal erinevate ravimeetodite jaoks meditsiinis.Mesenhümaalsetel tüvirakkudel on ainulaadne immuunfenotüüp ja immuunregulatsiooni võime.Seetõttu kasutatakse mesenhümaalseid tüvirakke juba laialdaselt tüvirakkude siirdamisel, koetehnoloogias ja elundite siirdamisel.Lisaks nendele rakendustele kasutatakse neid ideaalse vahendina koetehnoloogias külvirakkudena mitmetes põhi- ja kliinilistes uuringutes.Siiani ei ole mesenhümaalsete tüvirakkude kvaliteedikontrolliks laialdaselt aktsepteeritud meetodit ja standardit.Countstar Rigel saab jälgida nende tüvirakkude tootmise ja diferentseerumise ajal kontsentratsiooni, elujõulisust ja fenotüübi omadusi (ja nende muutusi).Countstar Rigelil on ka eelis saada täiendavat morfoloogilist teavet, mida pakuvad püsivad eredad väljad ja fluorestsentsipõhised pildisalvestused kogu rakukvaliteedi jälgimise protsessi jooksul.Countstar Rigel pakub kiiret, keerukat ja usaldusväärset meetodit tüvirakkude kvaliteedi kontrollimiseks.
Materjalid ja meetodid:
Rasvast pärinevad mesenhümaalsed tüvirakud (AdMSC-d) andis professor Nianmin Qi AO / PI värvimislahuse (Shanghai RuiYu, CF002).Antikehad: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC-sid kultiveeriti 37 ℃, 5% CO2 niisutatud inkubaatoris.Enne kasutamist seedida trüpsiiniga.
Antikehade käsiraamatuna järgiti CD-markeri värvimisprotseduuri.
CD-markeri tuvastamine Countstar Rigeliga:
1. Loodi signaali-värvi rakendusprotseduur, määrates PE-kanali kujutise PE fluorestsentsi.
2. Igast kambrist võeti 3 välja.
3. Pärast pildistamise ja esialgse analüüsi lõpuleviimist määrati FCS-tarkvaraga positiivse ja negatiivse transfektsiooni läve (logivärava) säte.
Tüvirakkude kvaliteedikontroll
Järgmine joonis (joonis 1) näitab protseduuri tüvirakuteraapia .
Joonis 1: Tüvirakuteraapia protseduur
Tulemused:
AdMSC-de kontsentratsiooni, elujõulisuse, läbimõõdu ja agregatsiooni määramine.
AdMSC-de elujõulisus määrati AO / PI abil. Loodi kahevärviline rakendusprotseduur, määrates rohelise kanali ja punase kanali kujutise AO ja PI fluorestsentsi ning heleda välja.Näidispildid on näidatud joonisel 2.
Joonis 2. AdMSC-de pildid enne ja pärast transporti.A. Enne transporti;näidatakse esinduspilti.B. Pärast transporti;näidatakse esinduspilti.
AdMSC-de elujõulisus muutus pärast transporti drastiliselt võrreldes transpordieelsega.Elujõulisus enne transporti oli 92%, kuid pärast transporti vähenes see 71%-ni.Tulemus on näidatud joonisel 3.
Joonis 3. AdMSC-de elujõulisuse tulemused (enne transporti ja pärast transporti)
Diameetri ja agregatsiooni määras samuti Countstar Rigel.AdMSC-de läbimõõt muutus pärast transporti drastiliselt võrreldes transpordieelsega.Läbimõõt enne transporti oli 19 µm, kuid pärast transporti suurenes see 21 µm-ni.Enne vedu oli summeeritud 20%, kuid peale vedu tõusis see 25%-ni.Countstar Rigeli jäädvustatud piltide põhjal muutus AdMSC-de fenotüüp pärast transporti drastiliselt.Tulemused on näidatud joonisel 4.
Joonis 4: läbimõõt ja agregatsiooni tulemused.V: AdMSC-de tüüpilised kujutised, AdMSC-de fenotüüp muutusid pärast transporti drastiliselt.B: Agregatsioon enne transporti oli 20%, kuid pärast transporti suurenes see 25%-ni.C: läbimõõt enne transporti oli 19 µm, kuid pärast transporti suurenes see 21 µm-ni.
Countstar Rigeli abil määrake AdMSC-de immunofenotüüp
AdMSC-de immunofenotüübi määras Countstar Rigel, AdMSC-sid inkubeeriti vastavalt erinevate antikehadega (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Signaalivärvi rakendusprotseduur loodi, määrates rohelise kanali pildi PE fluorestsentsi ja heleda välja.PE fluorestsentssignaali proovide võtmiseks kasutati maskina ereda välja pildi võrdlussegmenteerimist.Näidati CD105 tulemusi (joonis 5).
Joonis 5: AdMSC-de CD105 tulemused määras Countstar Rigel.V: CD105 positiivse protsendi kvantitatiivne analüüs erinevates proovides FCS express 5 plus tarkvaraga.B: kvaliteetsed pildid annavad täiendavat morfoloogilist teavet.C: Kontrollitud tulemused iga üksiku raku pisipiltide järgi jagasid FCS-i tarkvaratööriistad rakud erinevatesse rühmadesse vastavalt nende erinevale valguekspressioonile.
Teised antikehade tulemused on näidatud joonisel 6
Joonis 6: A: tüüpilise spindlikujulise morfoloogiaga ASC-de esinduspilt.Jäädvustatud OLYMPUS mikroskoobiga.Algne suurendus, (10x).B: ASC-de adipogeenset diferentseerumist tõendab ruteenipunane värvimine, mis näitab mineralisatsioonipiirkondi.Jäädvustatud OLYMPUS mikroskoobiga.Algne suurendus (10x).C: ASC-de Countstar FL iseloomustus.
Kokkuvõte:
Countstar FL saab jälgida nende tüvirakkude tootmise ja diferentseerumise ajal kontsentratsiooni, elujõulisust ja fenotüübi omadusi (ja nende muutusi).FCS express pakub funktsiooni iga signaaliraku ülevaatamiseks ja andmete kinnitamiseks pildi kaudu.Kasutaja võib julgelt ka järgmisi katseid Countstar Rigeli tulemuste põhjal läbi viia.Countstar Rigel pakub kiiret, keerukat ja usaldusväärset meetodit tüvirakkude kvaliteedi kontrollimiseks.
