Perifeerse vere mononukleaarseid rakke (PBMC) töödeldakse sageli täisverest eraldamiseks tihedusgradienttsentrifuugimise teel.Need rakud koosnevad lümfotsüütidest (T-rakud, B-rakud, NK-rakud) ja monotsüütidest, mida kasutatakse tavaliselt immunoloogia, rakuteraapia, nakkushaiguste ja vaktsiinide väljatöötamise valdkonnas.PBMC elujõulisuse ja kontsentratsiooni jälgimine ja analüüsimine on kliiniliste laborite, meditsiinialaste põhiuuringute ja immuunrakkude tootmise jaoks ülioluline.
Joonis 1. Värskest verest eraldatud PBMC tihedusgradienttsentrifuugimisega
AOPI Dual-fluoresces counting on testitüüp, mida kasutatakse rakkude kontsentratsiooni ja elujõulisuse tuvastamiseks.Lahus on akridiinoranži (roheline fluorestseeruv nukleiinhappevärv) ja propiidiumjodiidi (punaselt fluorestseeruv nukleiinhappevärv) kombinatsioon.Propidiumjodiid (PI) on membraani välistav värv, mis siseneb ainult kahjustatud membraanidega rakkudesse, samas kui akridiinoranž suudab tungida kõigisse populatsiooni rakkudesse.Kui tuumas on mõlemad värvained, vähendab propiidiumjodiid akridiinoranži fluorestsentsi fluorestsentsresonantsenergia ülekande (FRET) abil.Selle tulemusena värvuvad tervete membraanidega tuumaga rakud fluorestseeruvalt roheliseks ja neid loetakse elavateks, samas kui kahjustatud membraanidega tuumarakud värvivad ainult fluorestseeruvat punast ja loetakse Countstar® FL süsteemi kasutamisel surnuks.Tuumata materjalid, nagu punased verelibled, trombotsüüdid ja praht, ei fluorestseeru ja Countstar® FL tarkvara ignoreerib neid.
Eksperimentaalne protseduur:
1. Lahjendage PBMC proov PBS-ga 5 erinevaks kontsentratsiooniks;
2. Lisage 12 µl proovile 12 µl AO/PI lahust, segades õrnalt pipetiga;
3. Tõmmake 20 µl segu kambri slaidile;
4. Laske rakkudel umbes 1 minut kambris settida;
5. Pututage slaid Countstar FL instrumenti;
6. Valige "AO/PI elujõulisuse" test, seejärel testige Countstar FL-iga.
Ettevaatust: AO ja PI on potentsiaalsed kantserogeenid.Kasutajal on soovitatav kanda isikukaitsevahendeid (PPE), et vältida otsest kokkupuudet naha ja silmadega.
Tulemus:
1. PBMC ereda välja ja fluorestsentskujutised
AO- ja PI-värv värvivad mõlemad DNA-d rakkude raku tuumas.Seetõttu ei suuda trombotsüüdid, punased verelibled või rakujäätmed mõjutada PBMC kontsentratsiooni ja elujõulisuse tulemust.Elusrakke, surnud rakke ja prahti saab hõlpsasti eristada Countstar FL-i loodud piltide põhjal (joonis 1).
Joonis 2. PBMC ereda välja ja fluorestsentskujutised
2. PBMC kontsentratsioon ja elujõulisus
PBMC proove lahjendati 2, 4, 8 ja 16 korda PBS-ga, seejärel inkubeeriti neid proove AO/PI värviseguga ja analüüsiti vastavalt Countstar FL-iga.PBMC kontsentratsiooni ja elujõulisuse tulemus on näidatud järgmisel joonisel:
