غلظت مستقیم، زنده ماندن و اندازه گیری فنوتیپ سلول های بنیادی با استفاده از سیتومت تصویربرداری جدید

خلاصه: سلول های بنیادی مزانشیمی زیر مجموعه ای از سلول های بنیادی پرتوان هستند که می توانند از مزودرم جدا شوند.با ویژگی‌های تجدید خود تکراری و تمایز چند جهتی، پتانسیل بالایی برای درمان‌های مختلف در پزشکی دارند.سلول های بنیادی مزانشیمی دارای فنوتیپ ایمنی منحصر به فرد و توانایی تنظیم ایمنی هستند.بنابراین، سلول های بنیادی مزانشیمی در حال حاضر به طور گسترده در پیوند سلول های بنیادی، مهندسی بافت و پیوند اعضا استفاده می شود.و فراتر از این کاربردها، آنها به عنوان یک ابزار ایده آل در مهندسی بافت به عنوان سلول های بذر در یک سری آزمایش های تحقیقاتی پایه و بالینی استفاده می شوند.تاکنون روش و استاندارد قابل قبولی برای کنترل کیفیت سلول های بنیادی مزانشیمی وجود ندارد.Countstar Rigel می تواند غلظت، زنده ماندن و ویژگی های فنوتیپ (و تغییرات آنها) را در طول تولید و تمایز این سلول های بنیادی کنترل کند.Countstar Rigel همچنین دارای مزیت در به دست آوردن اطلاعات مورفولوژیکی اضافی است که توسط میدان روشن دائمی و ضبط تصویر مبتنی بر فلورسانس در طول کل فرآیند نظارت بر کیفیت سلول ارائه می شود.Countstar Rigel یک روش سریع، پیچیده و قابل اعتماد برای کنترل کیفیت سلول های بنیادی ارائه می دهد.

مواد و روش ها:
سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی (AdMSCs) توسط پروفسور Nianmin Qi، محلول رنگ آمیزی AO/PI (Shanghai RuiYu، CF002) اهدا شد.آنتی بادی: CD29، CD34، CD45، CD56، CD73، CD105، HLADR (شرکت BD).
AdMSCها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و 5% CO2 مرطوب شده کشت داده شدند.قبل از استفاده با تریپسین هضم کنید.
روش رنگ آمیزی نشانگر CD به عنوان راهنمای آنتی بادی دنبال شد.
تشخیص نشانگر سی دی با Countstar Rigel:
1. یک روش اعمال رنگ سیگنال با تنظیم کانال PE برای تصویر فلورسانس PE ایجاد شد.
2. از هر اتاق 3 میدان گرفته شد.
3. پس از تکمیل تصویربرداری و آنالیز اولیه، تنظیمات آستانه (log gate) برای ترانسفکشن مثبت و منفی توسط نرم افزار FCS تنظیم شد.

کنترل کیفیت سلول های بنیادی
شکل زیر (شکل 1) روند کار را نشان می دهد درمان با سلولهای بنیادی .

شکل 1: روش درمان با سلول های بنیادی

نتایج:
تعیین غلظت، زنده ماندن، قطر و تجمع AdMSCها.
زنده ماندن AdMSCها توسط AO/PI تعیین شد، یک روش کاربرد دو رنگ با تنظیم کانال سبز و کانال قرمز برای تصویر فلورسانس AO و PI، به علاوه یک میدان روشن ایجاد شد.تصاویر نمونه در شکل 2 نشان داده شده است.

شکل 2. تصاویر قبل و بعد از انتقال AdMSCها.الف. قبل از حمل و نقل؛یک تصویر نماینده نشان داده شده است.ب- پس از حمل و نقل؛یک تصویر نماینده نشان داده شده است.

قابلیت زنده ماندن AdMSCها پس از حمل و نقل در مقایسه با قبل از حمل به شدت تغییر کرد.زنده ماندن قبل از حمل و نقل 92٪ بود، اما پس از حمل و نقل به 71٪ کاهش یافت.نتیجه در شکل 3 نشان داده شد.

شکل 3. نتایج زنده ماندن AdMSCها (قبل از حمل و نقل و بعد از حمل و نقل)

قطر و تجمع نیز توسط Countstar Rigel تعیین شد.قطر AdMSCها پس از حمل و نقل در مقایسه با قبل از حمل به شدت تغییر کرد.قطر قبل از انتقال 19 میکرومتر بود، اما پس از انتقال به 21 میکرومتر افزایش یافت.تجمع قبل از حمل و نقل 20 درصد بود، اما پس از حمل به 25 درصد افزایش یافت.از تصاویر گرفته شده توسط Countstar Rigel، فنوتیپ AdMSCها پس از حمل و نقل به شدت تغییر کرد.نتایج در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل 4: نتایج قطر و تجمع.پاسخ: تصاویر معرف AdMSCها، فنوتیپ AdMSCها پس از حمل و نقل به شدت تغییر کرد.ب: تجمع قبل از حمل 20 درصد بوده اما پس از حمل به 25 درصد افزایش یافته است.ج: قطر قبل از انتقال 19 میکرومتر بود، اما پس از انتقال به 21 میکرومتر افزایش یافت.

تعیین ایمونوفنوتیپ AdMSCs توسط Countstar Rigel
ایمونوفنوتیپ AdMSCها توسط Countstar Rigel تعیین شد، AdMSCها به ترتیب با آنتی بادی های مختلف (CD29، CD34، CD45، CD56، CD73، CD105، HLA-DR) انکوبه شدند.یک روش اعمال رنگ سیگنال با تنظیم یک کانال سبز برای تصویر فلورسانس PE، به علاوه یک میدان روشن ایجاد شد.قطعه‌بندی مرجع تصویر میدان روشن به عنوان یک ماسک برای نمونه‌برداری از سیگنال فلورسانس PE استفاده شد.نتایج CD105 نشان داده شد (شکل 5).

شکل 5: نتایج CD105 AdMSCها توسط Countstar Rigel تعیین شد.پاسخ: تجزیه و تحلیل کمی درصد مثبت CD105 در نمونه های مختلف توسط نرم افزار FCS express 5 plus.ب: تصاویر با کیفیت بالا اطلاعات مورفولوژیکی بیشتری را ارائه می دهند.ج: نتایج تایید شده توسط ریز عکسها از هر سلول منفرد، ابزار نرم افزار FCS سلول ها را با توجه به بیان پروتئین های مختلف به گروه های مختلف تقسیم کرد.

سایر نتایج آنتی بادی ها در شکل 6 نشان داده شده است

شکل 6: الف: تصویری از ASCها با مورفولوژی دوکی شکل معمولی.توسط میکروسکوپ OLYMPUS گرفته شده است.بزرگنمایی اصلی، (10x).ب: تمایز چربی زایی ASCها با رنگ آمیزی روتنیوم قرمز نشان می دهد که مناطق کانی سازی را نشان می دهد.توسط میکروسکوپ OLYMPUS گرفته شده است.بزرگنمایی اصلی (10x).ج: مشخصه یابی Countstar FL از ASCها.

خلاصه:
Countstar FL می تواند غلظت، زنده ماندن و ویژگی های فنوتیپ (و تغییرات آنها) را در طول تولید و تمایز این سلول های بنیادی کنترل کند.FCS Express عملکردی را برای بررسی هر سلول سیگنال، اعتبارسنجی داده ها از طریق تصویر فراهم می کند.کاربر همچنین می تواند این اطمینان را داشته باشد که آزمایش های بعدی را بر اساس نتایج Countstar Rigel انجام دهد.Countstar Rigel یک روش سریع، پیچیده و قابل اعتماد برای کنترل کیفیت سلول های بنیادی ارائه می دهد.