تجزیه و تحلیل مستقیم لکوسیت ها در خون کامل بدون لیز

تجزیه و تحلیل لکوسیت ها در خون کامل یک آزمایش معمول در آزمایشگاه بالینی یا بانک خون است.غلظت و زنده ماندن لکوسیت ها شاخص حیاتی به عنوان کنترل کیفی ذخیره خون است.جدا از لکوسیت، خون کامل حاوی تعداد زیادی پلاکت، گلبول‌های قرمز خون یا بقایای سلولی است که تجزیه و تحلیل خون کامل را مستقیماً زیر میکروسکوپ یا شمارنده سلول‌های میدان روشن غیرممکن می‌سازد.روش‌های مرسوم برای شمارش گلبول‌های سفید شامل فرآیند لیز RBC است که زمان‌بر است.

AOPI Dual-fluoresces counting نوع سنجشی است که برای تشخیص غلظت و زنده ماندن سلول استفاده می شود.محلول ترکیبی از آکریدین نارنجی (رنگ اسید نوکلئیک فلورسنت سبز) و یدید پروپیدیوم (رنگ اسید نوکلئیک فلورسنت قرمز) است.پروپیدیوم یدید (PI) یک رنگ حذف غشایی است که فقط وارد سلول‌هایی می‌شود که غشاهای آسیب‌دیده دارند، در حالی که آکریدین نارنجی قادر است به تمام سلول‌های یک جمعیت نفوذ کند.هنگامی که هر دو رنگ در هسته وجود دارند، یدید پروپیدیوم باعث کاهش فلورسانس نارنجی آکریدین با انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET) می شود.در نتیجه، سلول‌های هسته‌دار با غشای سالم رنگ سبز فلورسنت می‌کنند و به عنوان زنده شمرده می‌شوند، در حالی که سلول‌های هسته‌دار با غشاهای آسیب‌دیده فقط قرمز فلورسنت را رنگ می‌کنند و هنگام استفاده از سیستم Countstar® Rigel مرده محسوب می‌شوند.

Countstar Rigel یک راه‌حل ایده‌آل برای بسیاری از سنجش‌های پیچیده توصیف جمعیت سلولی است که قادر به تجزیه و تحلیل سریع سلول‌های سفید خون در خون کامل است.

روش آزمایشی:

1. 20 میکرولیتر نمونه خون گرفته و نمونه را در 180 میکرولیتر PBS رقیق کنید.
2. 12 میکرولیتر محلول AO/PI را به نمونه 12 میکرولیتری اضافه کنید، به آرامی با پیپت مخلوط کنید.
3. 20 میکرولیتر مخلوط را داخل اسلاید محفظه بکشید.
4. اجازه دهید سلول ها به مدت حدود 1 دقیقه در محفظه مستقر شوند.
5. اسلاید را در ابزار Countstar FL حشره دهید.
6. سنجش "AO/PI Viability" را انتخاب کنید، سپس شناسه نمونه را برای این نمونه وارد کنید.
7. نسبت رقت، نوع سلول را انتخاب کنید، روی Run کلیک کنید تا آزمایش شروع شود.

احتیاط: AO و PI یک سرطان زا بالقوه است.توصیه می شود که اپراتور از تجهیزات حفاظت فردی (PPE) استفاده کند تا از تماس مستقیم با پوست و چشم جلوگیری شود.

نتیجه:

1. تصویر میدان روشن از خون کامل

در تصویر میدان روشن از کل خون، WBC ها در میان گلبول های قرمز قابل مشاهده نیستند.(شکل 1)

شکل 1 تصویر میدان روشن از خون کامل.

2. تصویر فلورسانس از خون کامل

رنگ‌های AO و PI هر دو رنگ‌آمیزی DNA در هسته سلولی هستند.بنابراین، پلاکت‌ها، گلبول‌های قرمز خون یا بقایای سلولی نمی‌توانند بر غلظت لکوسیت‌ها و نتیجه زنده‌مانی تأثیر بگذارند.لکوسیت های زنده (سبز) و لکوسیت های مرده (قرمز) به راحتی در تصاویر فلورسانس قابل مشاهده هستند.(شکل 2)

شکل 2 تصاویر فلورسانس از خون کامل.(آ).تصویر کانال AO;(ب) تصویر کانال PI.(C) تصاویر کانال AO و PI را ادغام کنید.

3. غلظت و زنده ماندن لکوسیت ها

نرم افزار Countstar FL به طور خودکار سلول های سه بخش محفظه را شمارش می کند و مقدار میانگین تعداد کل سلول های WBC (1202)، غلظت (1.83 x 106 سلول در میلی لیتر)، و درصد زنده بودن (82.04٪) را محاسبه می کند.تصاویر و داده های خون کامل را می توان به راحتی به صورت PDF، Image یا Excel برای تجزیه و تحلیل اضافی یا آرشیو داده ها صادر کرد.

شکل 3 اسکرین شات از نرم افزار Countstar Rigel