Abstrakti: Mesenkymaaliset kantasolut ovat osa pluripotentteja kantasoluja, jotka voidaan eristää mesodermista.Itsereplikaatioiden uusiutumiskykynsä ja monisuuntaisten erilaistumisominaisuuksiensa ansiosta niillä on suuri potentiaali lääketieteen erilaisiin hoitomuotoihin.Mesenkymaalisilla kantasoluilla on ainutlaatuinen immuunifenotyyppi ja immuunijärjestelmän säätelykyky.Siksi mesenkymaalisia kantasoluja käytetään jo laajalti kantasolusiirroissa, kudostekniikassa ja elinsiirroissa.Ja näiden sovellusten lisäksi niitä käytetään ihanteellisena työkaluna kudostekniikassa kylvösoluina perus- ja kliinisissä tutkimuskokeissa.Tähän mennessä ei ole olemassa laajalti hyväksyttyä menetelmää ja standardia mesenkymaalisten kantasolujen laadunvalvontaan.Countstar Rigel voi seurata pitoisuutta, elinkelpoisuutta ja fenotyyppiominaisuuksia (ja niiden muutoksia) näiden kantasolujen tuotannon ja erilaistumisen aikana.Countstar Rigelin etuna on myös morfologisen lisäinformaation saaminen pysyvän kirkaskentän ja fluoresenssipohjaisten kuvatallenteiden ansiosta koko solun laadun seurantaprosessin aikana.Countstar Rigel tarjoaa nopean, kehittyneen ja luotettavan menetelmän kantasolujen laadunvalvontaan.
Materiaalit ja menetelmät:
Rasvasta johdetut mesenkymaaliset kantasolut (AdMSC:t) lahjoitti professori Nianmin Qi, AO/PI-värjäysliuos (Shanghai RuiYu, CF002).Vasta-aine: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC:itä viljeltiin 37 ℃:n, 5 % CO2:n kostutetussa inkubaattorissa.Pilko trypsiinillä ennen käyttöä.
CD-markkerin värjäysmenettelyä noudatettiin vasta-aineen käsikirjana.
CD-merkin tunnistus Countstar Rigelillä:
1. Signaalivärin sovellusmenettely luotiin asettamalla PE-kanava kuvan PE-fluoresenssiksi.
2. Jokaisesta kammiosta otettiin 3 kenttää.
3. Kun kuvantaminen ja alkuperäinen analyysi oli suoritettu, kynnys (logiportti) -asetus positiiviselle ja negatiiviselle transfektiolle asetettiin FCS-ohjelmistolla.
Kantasolujen laadunvalvonta
Seuraavassa kuvassa (Kuva 1) on esitetty menettely, jossa kantasoluterapia .
Kuva 1: Kantasoluhoidon menettely
Tulokset:
AdMSC:iden pitoisuuden, elinkelpoisuuden, halkaisijan ja aggregaation määrittäminen.
AdMSC:iden elinkelpoisuus määritettiin AO/PI:llä. Kaksivärinen sovellusmenettely luotiin asettamalla vihreä kanava ja punainen kanava kuvan AO- ja PI-fluoresenssiin sekä kirkkaaseen kenttään.Esimerkkikuvat on esitetty kuvassa 2.
Kuva 2. Kuvat AdMSC:istä ennen kuljetusta ja kuljetuksen jälkeen.A. Ennen kuljetusta;edustava kuva näytetään.B. Kuljetuksen jälkeen;edustava kuva näytetään.
AdMSC:iden elinkelpoisuus muuttui dramaattisesti kuljetuksen jälkeen verrattuna ennen kuljetusta.Elinkelpoisuus ennen kuljetusta oli 92 %, mutta kuljetuksen jälkeen se laski 71 %:iin.Tulos näkyy kuvassa 3.
Kuva 3. AdMSC:iden elinkelpoisuustulokset (ennen kuljetusta ja kuljetuksen jälkeen)
Halkaisijan ja aggregaation määritti myös Countstar Rigel.AdMSC:iden halkaisija muuttui dramaattisesti kuljetuksen jälkeen verrattuna ennen kuljetusta.Halkaisija ennen kuljetusta oli 19 µm, mutta se kasvoi kuljetuksen jälkeen 21 µm:iin.Ennen kuljetusta yhteenlaskettu osuus oli 20 %, mutta se nousi kuljetuksen jälkeen 25 %:iin.Countstar Rigelin ottamien kuvien perusteella AdMSC:iden fenotyyppi muuttui dramaattisesti kuljetuksen jälkeen.Tulokset on esitetty kuvassa 4.
Kuva 4: Halkaisija ja aggregaatiotulokset.V: AdMSC:iden edustavat kuvat, AdMSC:iden fenotyyppi muuttuivat dramaattisesti kuljetuksen jälkeen.B: Aggregaatio ennen kuljetusta oli 20 %, mutta nousi kuljetuksen jälkeen 25 %:iin.C: Halkaisija ennen kuljetusta oli 19 µm, mutta se kasvoi kuljetuksen jälkeen 21 µm:iin.
Countstar Rigel määrittää AdMSC:iden immunofenotyypin
AdMSC:iden immunofenotyypin määritti Countstar Rigel, AdMSC:itä inkuboitiin vastaavasti eri vasta-aineiden kanssa (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Signaalivärin sovellusmenettely luotiin asettamalla vihreä kanava kuvan PE-fluoresenssiin sekä kirkkaaseen kenttään.Kirkkaan kentän kuvan vertailusegmentointia käytettiin maskina PE-fluoresenssisignaalin näytteenottoon.CD105:n tulokset esitettiin (kuvio 5).
Kuvio 5: AdMSC:iden CD105-tulokset määritti Countstar Rigel.V: CD105:n positiivisen prosenttiosuuden kvantitatiivinen analyysi eri näytteissä FCS express 5 plus -ohjelmistolla.B: Korkealaatuiset kuvat tarjoavat morfologista lisätietoa.C: Validoidut tulokset jokaisen yksittäisen solun miniatyyreillä, FCS-ohjelmistotyökalut jakoivat solut eri ryhmiin niiden vaihtelevan proteiinin ilmentymisen mukaan.
Muut vasta-ainetulokset on esitetty kuvassa 6
Kuva 6: A: Edustava kuva ASC:istä, joilla on tyypillinen karan muotoinen morfologia.Kuvattu OLYMPUS-mikroskoopilla.Alkuperäinen suurennus, (10x).B: ASC:iden adipogeeninen erilaistuminen on todistettu ruteeninpunaisella värjäyksellä, joka osoittaa mineralisoitumisalueita.Kuvattu OLYMPUS-mikroskoopilla.Alkuperäinen suurennus (10x).C: ASC:iden Countstar FL karakterisointi.
Yhteenveto:
Countstar FL voi seurata pitoisuutta, elinkelpoisuutta ja fenotyyppiominaisuuksia (ja niiden muutoksia) näiden kantasolujen tuotannon ja erilaistumisen aikana.FCS express tarjoaa toiminnon, joka tarkistaa jokaisen signaalisolun ja vahvistaa tiedot kuvan kautta.Käyttäjä voi myös luottaa seuraaviin kokeisiin Countstar Rigel -tulosten perusteella.Countstar Rigel tarjoaa nopean, kehittyneen ja luotettavan menetelmän kantasolujen laadunvalvontaan.
