Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont souvent traitées pour se séparer du sang total par centrifugation en gradient de densité.Ces cellules sont constituées de lymphocytes (cellules T, cellules B, cellules NK) et de monocytes, couramment utilisés dans le domaine de l'immunologie, de la thérapie cellulaire, des maladies infectieuses et du développement de vaccins.La surveillance et l'analyse de la viabilité et de la concentration des PBMC sont cruciales pour les laboratoires cliniques, la recherche fondamentale en sciences médicales et la production de cellules immunitaires.
Fig 1. PBMC isolé à partir de sang frais avec centrifugation en gradient de densité
Le comptage à double fluorescence AOPI est le type de test utilisé pour détecter la concentration et la viabilité des cellules.La solution est une combinaison d'acridine orange (la tache d'acide nucléique fluorescente verte) et d'iodure de propidium (la tache d'acide nucléique fluorescente rouge).L'iodure de propidium (PI) est un colorant d'exclusion membranaire qui ne pénètre que dans les cellules dont les membranes sont compromises, tandis que l'acridine orange est capable de pénétrer dans toutes les cellules d'une population.Lorsque les deux colorants sont présents dans le noyau, l'iodure de propidium provoque une réduction de la fluorescence orange de l'acridine par transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).En conséquence, les cellules nucléées avec des membranes intactes se colorent en vert fluorescent et sont comptées comme vivantes, tandis que les cellules nucléées avec des membranes compromises ne se colorent qu'en rouge fluorescent et sont comptées comme mortes lors de l'utilisation du système ® FL.Les matériaux non nucléés tels que les globules rouges, les plaquettes et les débris ne sont pas fluorescents et sont ignorés par le logiciel ® FL.
Procédure expérimentale:
1. Diluer l'échantillon PBMC en 5 concentrations différentes avec du PBS ;
2.Ajouter 12 µl de solution AO/PI dans 12 µl d'échantillon, mélanger délicatement avec une pipette ;
3.Aspirez 20 µl de mélange dans la lame de la chambre ;
4.Laissez les cellules se déposer dans la chambre pendant environ 1 minute ;
5.Insectez la lame dans l'instrument Countstar FL ;
6.Choisissez le test « Viabilité AO/PI », puis testez par Countstar FL.
Attention : AO et PI sont potentiellement cancérigènes.Il est recommandé à l'opérateur de porter un équipement de protection individuelle (EPI) pour éviter tout contact direct avec la peau et les yeux.
Résultat:
1. Images de champ lumineux et de fluorescence du PBMC
Les colorants AO et PI sont tous deux des colorants d'ADN dans le noyau cellulaire des cellules.Par conséquent, les plaquettes, les globules rouges ou les débris cellulaires ne peuvent pas affecter la concentration et la viabilité des PBMC.Les cellules vivantes, les cellules mortes et les débris peuvent être facilement distingués sur la base des images générées par FL (Figure 1).
Figure 2．Images en champ clair et en fluorescence du PBMC
2.Concentration et viabilité des PBMC
Les échantillons de PBMC ont été dilués 2, 4, 8 et 16 fois avec du PBS, puis ces échantillons ont été incubés avec un mélange de colorants AO/PI et analysés par FL respectivement.Le résultat de la concentration et de la viabilité des PBMC est illustré ci-dessous :
