L'analyse des leucocytes dans le sang total est un test de routine dans un laboratoire clinique ou une banque de sang.La concentration et la viabilité des leucocytes sont l'indice vital en tant que contrôle de la qualité du stockage du sang.Outre les leucocytes, le sang total contient un grand nombre de plaquettes, de globules rouges ou de débris cellulaires, ce qui rend impossible l'analyse directe du sang total au microscope ou au compteur de cellules à fond clair.Les méthodes conventionnelles pour compter les globules blancs impliquent un processus de lyse des globules rouges, qui prend du temps.
Le comptage à double fluorescence AOPI est le type de test utilisé pour détecter la concentration et la viabilité des cellules.La solution est une combinaison d'acridine orange (la tache d'acide nucléique fluorescente verte) et d'iodure de propidium (la tache d'acide nucléique fluorescente rouge).L'iodure de propidium (PI) est un colorant d'exclusion membranaire qui ne pénètre que dans les cellules dont les membranes sont compromises, tandis que l'acridine orange est capable de pénétrer dans toutes les cellules d'une population.Lorsque les deux colorants sont présents dans le noyau, l'iodure de propidium provoque une réduction de la fluorescence orange de l'acridine par transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).En conséquence, les cellules nucléées avec des membranes intactes se colorent en vert fluorescent et sont comptées comme vivantes, tandis que les cellules nucléées avec des membranes compromises ne se colorent qu'en rouge fluorescent et sont comptées comme mortes lors de l'utilisation du système ® Rigel.
Countstar Rigel est une solution idéale pour de nombreux tests complexes de caractérisation de populations cellulaires, permettant d'analyser rapidement les globules blancs dans le sang total.
Procédure expérimentale:
1.Prendre 20 µl d'échantillon de sang et diluer l'échantillon dans 180 µl de PBS.
2.Ajouter 12 µl de solution AO/PI dans 12 µl d'échantillon, mélanger délicatement avec une pipette ;
3.Aspirez 20 µl de mélange dans la lame de la chambre ;
4.Laissez les cellules se déposer dans la chambre pendant environ 1 minute ;
5.Insectez la lame dans l'instrument Countstar FL ;
6.Choisissez le test « Viabilité AO/PI », puis saisissez l'ID de l'échantillon pour cet échantillon.
7.Sélectionnez le taux de dilution, le type de cellule, puis cliquez sur "Exécuter" pour démarrer le test.
Attention : AO et PI sont potentiellement cancérigènes.Il est recommandé à l'opérateur de porter un équipement de protection individuelle (EPI) pour éviter tout contact direct avec la peau et les yeux.
Résultat:
1. Image en champ clair du sang total
Dans l'image en champ clair du sang total, les globules blancs ne sont pas visibles parmi les globules rouges.(Figure 1)
Figure 1 Image en fond clair de sang total.
2. Image de fluorescence du sang total
Les colorants AO et PI sont tous deux des colorants d'ADN dans le noyau cellulaire des cellules.Par conséquent, les plaquettes, les globules rouges ou les débris cellulaires ne peuvent pas affecter la concentration et la viabilité des leucocytes.Les leucocytes vivants (vert) et les leucocytes morts (rouge) sont facilement visualisés dans les images de fluorescence.(Figure 2)
Figure 2 Images de fluorescence de sang total.(UN).Image du canal AO ;(B) Image du canal PI ;(C) Fusionner les images des canaux AO et PI.
3. Concentration et viabilité des leucocytes
Le logiciel FL compte automatiquement les cellules de trois sections de chambre et calcule la valeur moyenne du nombre total de cellules WBC (1202), la concentration (1,83 x 106 cellules/ml) et le % de viabilité (82,04 %).Les images et les données du sang total peuvent être facilement exportées au format PDF, Image ou Excel pour une analyse supplémentaire ou un archivage des données.
Figure 3 Capture d'écran du logiciel Countstar Rigel
