As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) adoitan procesarse para separarse do sangue total mediante centrifugación por gradiente de densidade.Esas células están formadas por linfocitos (células T, células B, células NK) e monocitos, de uso habitual no campo da inmunoloxía, a terapia celular, as enfermidades infecciosas e o desenvolvemento de vacinas.O seguimento e análise da viabilidade e concentración de PBMC é crucial para os laboratorios clínicos, a investigación en ciencia médica básica e a produción de células inmunitarias.
Figura 1. PBMC illado de sangue fresco con centrifugación en gradiente de densidade
O reconto de fluorescencia dual AOPI é o tipo de ensaio utilizado para detectar a concentración e viabilidade celular.A solución é unha combinación de laranxa de acridina (a mancha de ácido nucleico fluorescente verde) e ioduro de propidio (a tinción de ácido nucleico fluorescente vermello).O ioduro de propidio (PI) é un colorante de exclusión de membrana que só entra nas células con membranas comprometidas, mentres que a laranxa de acridina é capaz de penetrar en todas as células dunha poboación.Cando ambos os colorantes están presentes no núcleo, o ioduro de propidio provoca unha redución da fluorescencia de laranxa de acridina pola transferencia de enerxía de resonancia da fluorescencia (FRET).Como resultado, as células nucleadas con membranas intactas téñense de verde fluorescente e cóntanse como vivas, mentres que as células nucleadas con membranas comprometidas só manchan de vermello fluorescente e cóntanse como mortas cando se usa o sistema Countstar® FL.O material non nucleado, como glóbulos vermellos, plaquetas e restos, non produce fluorescencia e o software Countstar® FL ignora.
Procedemento experimental:
1.Dilúe a mostra de PBMC en 5 concentracións diferentes con PBS;
2.Engade 12 µl de solución AO/PI a 12 µl de mostra, mesturando suavemente coa pipeta;
3.Draw 20µl de mestura no portaobjetos da cámara;
4.Deixa que as células se asenten na cámara durante aproximadamente 1 minuto;
5.Insecte o portaobjetos no instrumento Countstar FL;
6.Escolla o ensaio "Viabilidade AO/PI" e despois proba Countstar FL.
Precaución: AO e PI son un potencial canceríxeno.Recoméndase que o operador use equipos de protección individual (EPI) para evitar o contacto directo coa pel e os ollos.
Resultado:
1.Imaxes de campo brillante e fluorescencia do PBMC
O colorante AO e PI son ambas as tincións de ADN no núcleo celular das células.Polo tanto, as plaquetas, os glóbulos vermellos ou os restos celulares non poden afectar a concentración e a viabilidade dos PBMCs.As células vivas, as células mortas e os restos pódense distinguir facilmente a partir das imaxes xeradas por Countstar FL (Figura 1).
Figura 2. Imaxes de campo brillante e fluorescencia do PBMC
2.Concentración e viabilidade dos PBMC
As mostras de PBMC foron diluídas en 2, 4, 8 e 16 veces con PBS, despois esas mostras foron incubadas cunha mestura de colorantes AO/PI e analizadas por Countstar FL respectivamente.O resultado da concentración e viabilidade do PBMC móstrase na seguinte figura:
