परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) को अक्सर घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पूरे रक्त से अलग करने के लिए संसाधित किया जाता है।उन कोशिकाओं में लिम्फोसाइट्स (टी कोशिकाएं, बी कोशिकाएं, एनके कोशिकाएं) और मोनोसाइट्स होते हैं, जिनका उपयोग आमतौर पर इम्यूनोलॉजी, सेल थेरेपी, संक्रामक रोग और वैक्सीन विकास के क्षेत्र में किया जाता है।नैदानिक प्रयोगशालाओं, बुनियादी चिकित्सा विज्ञान अनुसंधान और प्रतिरक्षा सेल उत्पादन के लिए PBMC की व्यवहार्यता और एकाग्रता की निगरानी और विश्लेषण महत्वपूर्ण है।
अंजीर 1. घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ ताजा रक्त से पृथक PBMC
AOPI डुअल-फ्लोरोसेस काउंटिंग सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाने वाला परख प्रकार है।समाधान एक्रिडीन नारंगी (हरा-फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग) और प्रोपीडियम आयोडाइड (लाल-फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग) का संयोजन है।प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) एक झिल्ली अपवर्जन डाई है जो केवल समझौता झिल्ली वाली कोशिकाओं में प्रवेश करती है, जबकि एक्रिडीन ऑरेंज एक आबादी में सभी कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम है।जब दोनों रंग नाभिक में मौजूद होते हैं, तो प्रोपीडियम आयोडाइड फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (एफआरईटी) द्वारा एक्रिडीन ऑरेंज फ्लोरोसेंस में कमी का कारण बनता है।नतीजतन, अक्षुण्ण झिल्लियों वाली न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं फ्लोरोसेंट हरे रंग का दाग देती हैं और उन्हें जीवित के रूप में गिना जाता है, जबकि समझौता झिल्ली वाली न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं केवल फ्लोरोसेंट लाल रंग की होती हैं और काउंटस्टार® एफएल सिस्टम का उपयोग करते समय उन्हें मृत के रूप में गिना जाता है।गैर-न्यूक्लेटेड सामग्री जैसे लाल रक्त कोशिकाएं, प्लेटलेट्स और मलबे फ्लोरोसिस नहीं करते हैं और काउंटस्टार® एफएल सॉफ्टवेयर द्वारा अनदेखा किया जाता है।
प्रायोगिग विधि:
1. पीबीएमसी के नमूने को पीबीएस के साथ 5 अलग-अलग सांद्रता में पतला करें;
2. 12μl नमूने में 12μl एओ / पीआई समाधान जोड़ें, धीरे से पिपेट के साथ मिश्रित;
3. चैम्बर स्लाइड में 20μl मिश्रण तैयार करें;
4. कक्षों को लगभग 1 मिनट के लिए कक्ष में व्यवस्थित होने दें;
5. स्लाइड को काउंटस्टार FL इंस्ट्रूमेंट में इंसेक्ट करें;
6. "एओ/पीआई व्यवहार्यता" परख चुनें, फिर काउंटस्टार एफएल द्वारा परीक्षण करें।
सावधानी: AO और PI एक संभावित कार्सिनोजेन हैं।यह अनुशंसा की जाती है कि ऑपरेटर त्वचा और आंखों के सीधे संपर्क से बचने के लिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।
परिणाम:
1. पीबीएमसी के उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियां
एओ और पीआई डाई दोनों ही कोशिकाओं के सेल न्यूक्लियस में डीएनए के दाग हैं।इसलिए, प्लेटलेट्स, लाल रक्त कोशिकाएं, या सेलुलर मलबे PBMCs एकाग्रता और व्यवहार्यता परिणाम को प्रभावित करने में असमर्थ हैं।जीवित कोशिकाओं, मृत कोशिकाओं और मलबे को काउंटस्टार FL (चित्र 1) द्वारा उत्पन्न छवियों के आधार पर आसानी से पहचाना जा सकता है।
चित्र 2．पीबीएमसी के उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियां
2. पीबीएमसी की एकाग्रता और व्यवहार्यता
पीबीएमसी के नमूनों को पीबीएस के साथ 2, 4, 8 और 16 बार पतला किया गया था, फिर उन नमूनों को एओ / पीआई डाई मिश्रण के साथ ऊष्मायन किया गया और क्रमशः काउंटस्टार एफएल द्वारा विश्लेषण किया गया।पीबीएमसी की एकाग्रता और व्यवहार्यता का परिणाम नीचे दिए गए आंकड़े में दिखाया गया है:
