Sažetak: Mezenhimalne matične stanice su podskup pluripotentnih matičnih stanica koje se mogu izolirati iz mezoderma.Svojim karakteristikama obnavljanja samoreplikacije i višesmjerne diferencijacije posjeduju veliki potencijal za različite terapije u medicini.Mezenhimalne matične stanice imaju jedinstven imunološki fenotip i sposobnost imunološke regulacije.Stoga se mezenhimske matične stanice već naširoko koriste u transplantaciji matičnih stanica, tkivnom inženjerstvu i transplantaciji organa.Osim ovih primjena, koriste se kao idealan alat u tkivnom inženjeringu kao stanice sijača u nizu osnovnih i kliničkih istraživačkih eksperimenata.Do sada ne postoji široko prihvaćena metoda i standard za kontrolu kvalitete mezenhimskih matičnih stanica.Countstar Rigel može pratiti koncentraciju, vitalnost i karakteristike fenotipa (i njihove promjene) tijekom proizvodnje i diferencijacije ovih matičnih stanica.Countstar Rigel također ima prednost u dobivanju dodatnih morfoloških informacija, dobivenih stalnim svijetlim poljem i snimkama slike temeljene na fluorescenciji tijekom cijelog procesa praćenja kvalitete stanica.Countstar Rigel nudi brzu, sofisticiranu i pouzdanu metodu za kontrolu kvalitete matičnih stanica.
Materijali i metode:
Mezenhimske matične stanice dobivene iz masnoće (AdMSC) darovao je profesor Nianmin Qi, otopina za bojenje AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Antitijela: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC su uzgajani u inkubatoru na 37 ℃, 5% CO2 vlažnom.Prije upotrebe probaviti s tripsinom.
Postupak bojanja CD markera slijedio je kao priručnik za antitijela.
Detekcija CD markera s Countstar Rigelom:
1. Postupak primjene boje signala kreiran je postavljanjem PE kanala na sliku PE fluorescencije.
2. Iz svake komore zarobljena su 3 polja.
3. Nakon dovršetka snimanja i početne analize, postavka praga (log gate) za pozitivnu i negativnu transfekciju postavljena je FCS softverom.
Kontrola kvalitete matičnih stanica
Sljedeća slika (slika 1) prikazuje postupak terapija matičnim stanicama .
Slika 1: Postupak za terapiju matičnim stanicama
Rezultati:
Određivanje koncentracije, održivosti, promjera i agregacije AdMSC-a.
Vijabilnost AdMSC-a određena je AO/PI. Postupak primjene u dvije boje je kreiran postavljanjem zelenog kanala i crvenog kanala na sliku AO i PI fluorescencije, plus svijetlo polje.Primjeri slika prikazani su na slici 2.
Slika 2. Slike prije transporta i nakon transporta AdMSC-a.A. Prije transporta;prikazana je reprezentativna slika.B. Nakon transporta;prikazana je reprezentativna slika.
Održivost AdMSC-a drastično se promijenila nakon transporta u usporedbi s prije transporta.Održivost prije transporta bila je 92%, ali se nakon transporta smanjila na 71%.Rezultat je prikazan na slici 3.
Slika 3. Rezultati održivosti AdMSC-a (prije transporta i nakon transporta)
Promjer i agregaciju također je odredio Countstar Rigel.Promjer AdMSC-a je drastično promijenjen nakon transporta u usporedbi s prije transporta.Promjer prije transporta bio je 19 µm, ali se nakon transporta povećao na 21 µm.Agregacija prije transporta iznosila je 20%, ali se nakon transporta povećala na 25%.Prema slikama koje je snimio Countstar Rigel, fenotip AdMSC-a drastično se promijenio nakon transporta.Rezultati su prikazani na slici 4.
Slika 4: Promjer i rezultati agregacije.O: Reprezentativne slike AdMSC-a, fenotip AdMSC-a drastično su promijenjeni nakon transporta.B: Agregacija prije transporta bila je 20%, ali se povećala na 25% nakon transporta.C: Promjer prije transporta bio je 19 µm, ali se nakon transporta povećao na 21 µm.
Odredite imunofenotip AdMSC-a po Countstar Rigelu
Imunofenotip AdMSC-a odredio je Countstar Rigel, AdMSC-ovi su inkubirani s različitim protutijelima (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Procedura primjene boje signala stvorena je postavljanjem zelenog kanala za prikaz PE fluorescencije, plus svijetlo polje.Referentna segmentacija slike svijetlog polja primijenjena je kao maska za uzorkovanje PE fluorescentnog signala.Prikazani su rezultati CD105 (slika 5).
Slika 5: CD105 rezultate AdMSC-a odredio je Countstar Rigel.O: Kvantitativna analiza pozitivnog postotka CD105 u različitim uzorcima pomoću softvera FCS express 5 plus.B: Visokokvalitetne slike pružaju dodatne morfološke informacije.C: Validirani rezultati sličicama svake pojedine stanice, softverski alati FCS podijelili su stanice u različite skupine prema njihovoj različitoj ekspresiji proteina.
Ostali rezultati antitijela prikazani su na slici 6
Slika 6: A: Reprezentativna slika ASC s tipičnom morfologijom u obliku vretena.Snimljeno mikroskopom OLYMPUS.Originalno povećanje, (10x).B: Adipogena diferencijacija ASC-a dokazana je bojenjem rutenij crvenom koja pokazuje područja mineralizacije.Snimljeno mikroskopom OLYMPUS.Originalno povećanje (10x).C: Countstar FL karakterizacija ASC-a.
Sažetak:
Countstar FL može pratiti koncentraciju, vitalnost i karakteristike fenotipa (i njihove promjene) tijekom proizvodnje i diferencijacije ovih matičnih stanica.FCS express pruža funkciju za pregled svake signalne ćelije, provjeru podataka kroz sliku.Korisnik također može imati povjerenja da provede sljedeće eksperimente na temelju rezultata Countstar Rigel.Countstar Rigel nudi brzu, sofisticiranu i pouzdanu metodu za kontrolu kvalitete matičnih stanica.
