Mononuklearne stanice periferne krvi (PBMC) često se obrađuju radi odvajanja od pune krvi centrifugiranjem s gradijentom gustoće.Te se stanice sastoje od limfocita (T stanice, B stanice, NK stanice) i monocita, koji se obično koriste u području imunologije, stanične terapije, zaraznih bolesti i razvoja cjepiva.Praćenje i analiza održivosti i koncentracije PBMC ključna je za kliničke laboratorije, temeljna medicinska znanstvena istraživanja i proizvodnju imunoloških stanica.
Slika 1. Izolirani PBMC iz svježe krvi centrifugiranjem s gradijentom gustoće
AOPI Dvostruko fluorescentno brojanje je vrsta analize koja se koristi za otkrivanje koncentracije i vitalnosti stanica.Otopina je kombinacija akridin naranče (zeleno-fluorescentna boja nukleinske kiseline) i propidij jodida (crvena fluorescentna boja nukleinske kiseline).Propidijev jodid (PI) je membransko isključenje boje koje ulazi samo u stanice s ugroženim membranama, dok akridin narančasta može prodrijeti u sve stanice u populaciji.Kada su obje boje prisutne u jezgri, propidij jodid uzrokuje smanjenje akridin narančaste fluorescencije prijenosom energije fluorescentne rezonancije (FRET).Kao rezultat toga, stanice s jezgrom s netaknutim membranama boje se fluorescentno zelenom bojom i broje se kao žive, dok stanice s jezgrom s ugroženim membranama boje samo fluorescentno crveno i broje se kao mrtve kada se koristi Countstar® FL sustav.Materijali bez jezgre kao što su crvena krvna zrnca, trombociti i ostaci ne fluoresciraju i softver Countstar® FL ih ignorira.
Eksperimentalna procedura:
1. Razrijedite uzorak PBMC u 5 različitih koncentracija s PBS;
2.Dodajte 12 µl AO/PI otopine u 12 µl uzorka, lagano pomiješano s pipetom;
3. Uvucite 20 µl smjese u stakalce komore;
4. Pustite stanice da se smjeste u komori oko 1 minute;
5. Insektirajte tobogan u instrument Countstar FL;
6. Odaberite "AO/PI Viability" test, a zatim ga testirajte od strane Countstar FL.
Oprez: AO i PI su potencijalni kancerogen.Preporuča se da operater nosi osobnu zaštitnu opremu (PPE) kako bi izbjegao izravan kontakt s kožom i očima.
Proizlaziti:
1. Svjetlo polje i fluorescentne slike PBMC-a
AO i PI boja oboje su DNK u staničnoj jezgri stanica.Stoga, trombociti, crvene krvne stanice ili stanični ostaci ne mogu utjecati na koncentraciju PBMC-a i rezultat održivosti.Žive stanice, mrtve stanice i krhotine mogu se lako razlikovati na temelju slika koje je generirao Countstar FL (slika 1).
Slika 2. Slike svijetlog polja i fluorescencije PBMC-a
2. Koncentracija i održivost PBMC-a
Uzorci PBMC razrijeđeni su 2, 4, 8 i 16 puta s PBS, zatim su ti uzorci inkubirani s AO/PI smjesom boja i analizirani od strane Countstar FL.Rezultat koncentracije i održivosti PBMC-a prikazan je na donjoj slici:
