Analiza leukocita u punoj krvi rutinski je test u kliničkom laboratoriju ili banci krvi.Koncentracija i održivost leukocita vitalni su pokazatelj kontrole kvalitete skladištenja krvi.Osim leukocita, puna krv sadrži veliki broj trombocita, crvenih krvnih stanica ili staničnih ostataka, što onemogućuje analizu pune krvi izravno pod mikroskopom ili brojačem stanica svijetlog polja.Konvencionalne metode brojanja bijelih krvnih stanica uključuju proces lize eritrocita, koji je dugotrajan.
AOPI Dvostruko fluorescentno brojanje je vrsta analize koja se koristi za otkrivanje koncentracije i vitalnosti stanica.Otopina je kombinacija akridin naranče (zeleno-fluorescentna boja nukleinske kiseline) i propidij jodida (crvena fluorescentna boja nukleinske kiseline).Propidijev jodid (PI) je membransko isključenje boje koje ulazi samo u stanice s ugroženim membranama, dok akridin narančasta može prodrijeti u sve stanice u populaciji.Kada su obje boje prisutne u jezgri, propidij jodid uzrokuje smanjenje akridin narančaste fluorescencije prijenosom energije fluorescentne rezonancije (FRET).Kao rezultat toga, stanice s jezgrom s netaknutim membranama boje se fluorescentno zelenom bojom i broje se kao žive, dok stanice s jezgrom s ugroženim membranama boje samo fluorescentno crveno i broje se kao mrtve kada se koristi sustav Countstar® Rigel.
Countstar Rigel je idealno rješenje za mnoge složene testove karakterizacije stanične populacije, omogućavajući brzu analizu bijelih krvnih stanica u punoj krvi.
Eksperimentalna procedura:
1. Uzmite 20 µl uzorka krvi i razrijedite uzorak u 180 µl PBS-a.
2.Dodajte 12 µl AO/PI otopine u 12 µl uzorka, lagano pomiješano s pipetom;
3. Uvucite 20 µl smjese u stakalce komore;
4. Pustite stanice da se smjeste u komori oko 1 minute;
5. Insektirajte tobogan u instrument Countstar FL;
6.Odaberite test “AO/PI Viability”, a zatim unesite ID uzorka za ovaj uzorak.
7. Odaberite Omjer razrjeđenja, Vrsta ćelije, kliknite 'Pokreni' za početak testa.
Oprez: AO i PI su potencijalni kancerogen.Preporuča se da operater nosi osobnu zaštitnu opremu (PPE) kako bi izbjegao izravan kontakt s kožom i očima.
Proizlaziti:
1. Bright Field Slika pune krvi
Na slici u svijetlom polju pune krvi, WBC nisu vidljivi među crvenim krvnim stanicama.(slika 1)
Slika 1. Slika pune krvi u svijetlom polju.
2. Fluorescentna slika pune krvi
AO i PI boja oboje su DNK u staničnoj jezgri stanica.Stoga trombociti, crvene krvne stanice ili stanični ostaci ne mogu utjecati na koncentraciju leukocita i rezultat vitalnosti.Živi leukociti (zeleni) i mrtvi leukociti (crveni) lako se vizualiziraju na fluorescentnim slikama.(slika 2)
Slika 2. Fluorescentne slike pune krvi.(A).Slika AO kanala;(B) Slika PI kanala;(C) Spojite slike AO i PI kanala.
3. Koncentracija i održivost leukocita
Softver Countstar FL automatski broji stanice u tri odjeljka komore i izračunava prosječnu vrijednost ukupnog broja WBC stanica (1202), koncentracije (1,83 x 106 stanica/ml) i % održivosti (82,04%).Slike i podaci pune krvi mogu se jednostavno izvesti kao PDF, Image ili Excel za dodatnu analizu ili arhiviranje podataka.
Slika 3 Snimka zaslona softvera Countstar Rigel
