Ծայրամասային արյան միամիջուկային բջիջները (PBMCs) հաճախ մշակվում են ամբողջական արյունից անջատվելու համար խտության գրադիենտ ցենտրիֆուգացման միջոցով:Այդ բջիջները բաղկացած են լիմֆոցիտներից (T բջիջներ, B բջիջներ, NK բջիջներ) և մոնոցիտներից, որոնք սովորաբար օգտագործվում են իմունոլոգիայի, բջջային թերապիայի, վարակիչ հիվանդությունների և պատվաստանյութերի մշակման ոլորտում:PBMC-ի կենսունակության և կոնցենտրացիայի մոնիտորինգը և վերլուծությունը կարևոր նշանակություն ունեն կլինիկական լաբորատորիաների, հիմնական բժշկական գիտությունների հետազոտության և իմունային բջիջների արտադրության համար:
Նկ 1. Մեկուսացված PBMC թարմ արյունից՝ խտության գրադիենտ ցենտրիֆուգմամբ
AOPI Dual-fluoresces counting-ը վերլուծության տեսակն է, որն օգտագործվում է բջիջների կոնցենտրացիան և կենսունակությունը հայտնաբերելու համար:Լուծումը ակրիդին նարնջի (կանաչ-ֆլուորեսցենտ նուկլեինաթթվի բիծ) և պրոպիդիում յոդիդի (կարմիր-լյումինեսցենտ նուկլեինաթթվի բիծ) համադրություն է:Պրոպիդիումի յոդիդը (PI) մեմբրանի բացառող ներկ է, որը մտնում է միայն վնասված թաղանթներով բջիջներ, մինչդեռ ակրիդին նարնջագույնը կարողանում է ներթափանցել պոպուլյացիայի բոլոր բջիջները:Երբ երկու ներկերն էլ առկա են միջուկում, պրոպիդիումի յոդիդը հանգեցնում է ակրիդինային նարնջի ֆլուորեսցենտության նվազեցմանը ֆլյուորեսցենտային ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցման (FRET) միջոցով:Արդյունքում, անձեռնմխելի թաղանթներով միջուկավորված բջիջները ներկում են լյումինեսցենտ կանաչ և համարվում են կենդանի, մինչդեռ վնասված թաղանթներով միջուկավորված բջիջները ներկում են միայն լյումինեսցենտ կարմիր և համարվում են մեռած՝ Countstar® FL համակարգը օգտագործելիս:Ոչ միջուկային նյութերը, ինչպիսիք են արյան կարմիր բջիջները, թրոմբոցիտները և բեկորները, չեն լուսանում և անտեսվում են Countstar® FL ծրագրաշարի կողմից:
Փորձարարական ընթացակարգ.
1. PBMC նմուշը նոսրացրեք 5 տարբեր կոնցենտրացիաների մեջ PBS-ով;
2. Ավելացրեք 12 մկլ AO/PI լուծույթ 12 մկլ նմուշի մեջ, նրբորեն խառնված պիպետտի հետ;
3. Քաշեք 20 մկլ խառնուրդը խցիկի սլայդի մեջ;
4. Թույլ տվեք, որ բջիջները նստեն խցիկում մոտ 1 րոպե;
5. Ներդրեք սլայդը Countstar FL գործիքի մեջ;
6. Ընտրեք «AO/PI կենսունակության» վերլուծությունը, այնուհետև փորձարկեք Countstar FL-ի կողմից:
Ուշադրություն. AO-ն և PI-ն պոտենցիալ քաղցկեղածին են:Խորհուրդ է տրվում, որ օպերատորը կրի անձնական պաշտպանիչ սարքավորումներ (PPE)՝ մաշկի և աչքերի հետ անմիջական շփումից խուսափելու համար:
Արդյունք:
1. PBMC-ի պայծառ դաշտի և լյումինեսցենտային պատկերներ
AO և PI ներկերը երկուսն էլ ԴՆԹ-ի բծեր են բջիջների միջուկում:Հետևաբար, թրոմբոցիտները, կարմիր արյան բջիջները կամ բջջային բեկորները չեն կարող ազդել PBMC-ների կոնցենտրացիայի և կենսունակության արդյունքի վրա:Կենդանի բջիջները, մեռած բջիջները և բեկորները հեշտությամբ կարելի է տարբերել Countstar FL-ի կողմից ստեղծված պատկերների հիման վրա (Նկար 1):
Նկար 2. PBMC-ի պայծառ դաշտի և լյումինեսցենտային պատկերներ
2. PBMC-ի համակենտրոնացում և կենսունակություն
PBMC նմուշները նոսրացվել են 2, 4, 8 և 16 անգամ PBS-ով, այնուհետև այդ նմուշները ինկուբացվել են AO/PI ներկերի խառնուրդով և համապատասխանաբար վերլուծվել Countstar FL-ով:PBMC-ի համակենտրոնացման և կենսունակության արդյունքը ներկայացված է ստորև ներկայացված նկարում.
