Einkjarna frumur í útlægum blóði (PBMC) eru oft unnar til að aðskiljast frá heilblóði með þéttleikastigsskilvindu.Þessar frumur samanstanda af eitilfrumum (T frumum, B frumum, NK frumum) og einfrumur, sem almennt eru notaðar á sviði ónæmisfræði, frumumeðferðar, smitsjúkdóma og þróun bóluefna.Vöktun og greining á lífvænleika og styrk PBMC er mikilvægt fyrir klínískar rannsóknarstofur, grunnrannsóknir í læknavísindum og framleiðslu ónæmisfrumna.
Mynd 1. Einangrað PBMC úr fersku blóði með Density halli skilvindu
AOPI Dual-fluoresces talning er greiningartegundin sem notuð er til að greina frumustyrk og lífvænleika.Lausnin er sambland af acridine appelsínugult (græn-flúrljómandi kjarnsýrubletturinn) og própídíumjoðíði (rauðflúrljómandi kjarnsýrubletturinn).Própídínjoðíð (PI) er himnuútilokunarlitarefni sem fer aðeins inn í frumur með skerta himnur, en acridín appelsínugult er fær um að komast í gegnum allar frumur í þýði.Þegar báðir litarefnin eru til staðar í kjarnanum veldur própídínjoðíði minnkun á akridín appelsínuflúrljómun með flúrljómunarresonance energy transfer (FRET).Fyrir vikið litast frumur með ósnortnar himnur flúrljómandi grænum og eru taldar lifandi, en kjarnafrumur með skerta himnur litast aðeins flúrljómandi rauðar og eru taldar dauðar þegar Countstar® FL kerfið er notað.Kjarnalaust efni eins og rauð blóðkorn, blóðflögur og rusl flúrljóma ekki og er hunsað af Countstar® FL hugbúnaðinum.
Tilraunaaðferð:
1. Þynntu PBMC sýnið í 5 mismunandi styrkleika með PBS;
2.Bætið 12µl AO/PI lausn í 12µl sýni, blandað varlega með pípettu;
3. Dragðu 20µl blöndu í hólfsglas;
4.Leyfðu frumunum að setjast að í hólfinu í um það bil 1 mínútu;
5. Skordýrið rennibrautina í Countstar FL tækið;
6.Veldu „AO/PI Viability“ prófið og prófaðu síðan með Countstar FL.
Varúð: AO og PI er hugsanlegt krabbameinsvaldandi.Mælt er með því að rekstraraðili noti persónuhlífar (PPE) til að forðast bein snertingu við húð og augu.
Niðurstaða:
1.Björtu sviði og flúrljómun myndir af PBMC
AO og PI liturinn eru bæði litarefni DNA í frumukjarna frumna.Þess vegna geta blóðflögur, rauð blóðkorn eða frumurusl ekki haft áhrif á styrk PBMCs og niðurstöður lífvænleika.Auðvelt er að greina lifandi frumur, dauðar frumur og rusl á grundvelli myndanna sem Countstar FL myndar (Mynd 1).
Mynd 2．Björtu sviði og flúrljómun myndir af PBMC
2.Samþjöppun og hagkvæmni PBMC
PBMC sýnin voru þynnt 2, 4, 8 og 16 sinnum með PBS, síðan voru þau sýni ræktuð með AO/PI litarblöndu og greind með Countstar FL í sömu röð.Niðurstaða styrks og lífvænleika PBMC er sýnd eins og hér að neðan mynd:
