L'analisi dei leucociti nel sangue intero è un'analisi di routine in un laboratorio clinico o in una banca del sangue.La concentrazione e la vitalità dei leucociti sono l'indice vitale come controllo di qualità della conservazione del sangue.Oltre ai leucociti, il sangue intero contiene un gran numero di piastrine, globuli rossi o detriti cellulari, che rendono impossibile l'analisi del sangue intero direttamente al microscopio o al contatore di cellule in campo chiaro.I metodi convenzionali per contare i globuli bianchi coinvolgono il processo di lisi dei globuli rossi, che richiede molto tempo.
Il conteggio a doppia fluorescenza AOPI è il tipo di test utilizzato per rilevare la concentrazione e la vitalità cellulare.La soluzione è una combinazione di acridina arancione (il colorante verde fluorescente dell'acido nucleico) e ioduro di propidio (il colorante rosso fluorescente dell'acido nucleico).Lo ioduro di propidio (PI) è un colorante di esclusione della membrana che entra solo nelle cellule con membrane compromesse, mentre l'arancio di acridina è in grado di penetrare in tutte le cellule di una popolazione.Quando entrambi i coloranti sono presenti nel nucleo, lo ioduro di propidio provoca una riduzione della fluorescenza arancione di acridina mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).Di conseguenza, le cellule nucleate con membrane intatte si colorano di verde fluorescente e vengono conteggiate come vive, mentre le cellule nucleate con membrane compromesse si colorano solo di rosso fluorescente e vengono conteggiate come morte quando si utilizza il sistema Countstar® Rigel.
Countstar Rigel è una soluzione ideale per molti saggi complessi di caratterizzazione della popolazione cellulare, consentendo di analizzare rapidamente i globuli bianchi nel sangue intero.
Procedura sperimentale:
1.Prelevare 20 µl di campione di sangue e diluire il campione in 180 µl di PBS.
2.Aggiungere 12 µl di soluzione AO/PI in 12 µl di campione, miscelare delicatamente con una pipetta;
3.Aspirare 20 µl di miscela nel vetrino della camera;
4.Lasciare che le cellule si depositino nella camera per circa 1 minuto;
5.Inserire il vetrino nello strumento Countstar FL;
6.Scegliere il test "AO/PI Viability", quindi Immettere l'ID campione per questo campione.
7.Selezionare Rapporto diluizione, Tipo di cella, quindi fare clic su "Esegui" per avviare il test.
Attenzione: AO e PI sono un potenziale cancerogeno.Si raccomanda all'operatore di indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) per evitare il contatto diretto con la pelle e gli occhi.
Risultato:
1. Immagine in campo chiaro di sangue intero
Nell'immagine in campo chiaro del sangue intero, i globuli bianchi non sono visibili tra i globuli rossi.(Figura 1)
Figura 1 Immagine in campo chiaro di sangue intero.
2. Immagine a fluorescenza del sangue intero
Il colorante AO e PI sono entrambi coloranti del DNA nel nucleo cellulare delle cellule.Pertanto, piastrine, globuli rossi o detriti cellulari non sono in grado di influenzare la concentrazione dei leucociti e il risultato di vitalità.I leucociti vivi (verde) e i leucociti morti (rosso) sono facilmente visualizzati nelle immagini a fluorescenza.(Figura 2)
Figura 2 Immagini a fluorescenza del sangue intero.(UN).Immagine del canale AO;(B) Immagine del canale PI;(C) Unisci le immagini di AO e PI Channel.
3. Concentrazione e vitalità dei leucociti
Il software Countstar FL conta automaticamente le cellule di tre sezioni della camera e calcola il valore medio della conta leucocitaria totale (1202), della concentrazione (1,83 x 106 cellule/ml) e della % di vitalità (82,04%).Le immagini ei dati del sangue intero possono essere facilmente esportati come PDF, immagine o Excel per ulteriori analisi o archiviazione dei dati.
Figura 3 Screenshot del software Countstar Rigel
