ניתוח ישיר של לויקוציטים בדם מלא ללא ליסינג

ניתוח הלויקוציטים בדם מלא הוא בדיקה שגרתית במעבדה קלינית או בבנק הדם.הריכוז והכדאיות של הלויקוציטים הם המדד החיוני כבקרת איכות של אחסון הדם.מלבד לויקוציטים, דם מלא מכיל מספר רב של טסיות דם, כדוריות דם אדומות או פסולת תאים, מה שלא מאפשר לנתח דם מלא ישירות מתחת למיקרוסקופ או למונה תאי השדה הבהיר.שיטות קונבנציונליות לספירת תאי דם לבנים כרוכה בתהליך תמוגה של RBC, אשר גוזל זמן.

ספירת AOPI Dual-fluoresces היא סוג הבדיקה המשמש לזיהוי ריכוז תאים וכדאיות.הפתרון הוא שילוב של אקרידין כתום (כתם חומצת הגרעין הירוק-ניאון) ופרופידיום יודיד (כתם חומצת הגרעין האדומה-ניאון).Propidium iodide (PI) הוא צבע אי הכללת ממברנה שנכנס רק לתאים עם ממברנות פגומות, בעוד אקרידין כתום מסוגל לחדור לכל התאים באוכלוסייה.כאשר שני הצבעים נמצאים בגרעין, יודיד פרופידיום גורם להפחתה של הקרינה הכתומה של אקרידין על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET).כתוצאה מכך, תאים בעלי גרעין עם ממברנות שלמות צובעים בירוק ניאון ונספרים כחיים, בעוד שתאים בעלי גרעין עם ממברנות פגומות צובעים רק באדום ניאון ונספרים כמתים בעת שימוש במערכת Countstar® Rigel.

Countstar Rigel הוא פתרון אידיאלי עבור מבחני אפיון רבים של אוכלוסיית תאים מורכבים, המאפשרים לנתח במהירות תאי דם לבנים בדם מלא.

הליך ניסיוני:

1. קח 20 µl של דגימת דם ודלל את הדגימה ב-180 µl של PBS.
2. הוסף תמיסת AO/PI של 12µl לתוך מדגם 12µl, מעורבב בעדינות עם פיפטה;
3. צייר תערובת של 20µl לתוך שקופית החדר;
4. אפשר לתאים להתיישב בתא למשך כדקה אחת;
5. חרקים את השקופית לתוך מכשיר Countstar FL;
6. בחר במבחן "AO/PI Viability", ולאחר מכן הזן מזהה דגימה עבור דגימה זו.
7. בחר יחס דילול, סוג תא, לחץ על 'הפעלה' כדי להתחיל בבדיקה.

זהירות: AO ו-PI הם חומר מסרטן פוטנציאלי.מומלץ שהמפעיל ילבש ציוד מגן אישי (PPE) כדי להימנע ממגע ישיר עם העור והעיניים.

תוֹצָאָה:

1. תמונת שדה מוארת של דם מלא

בתמונת השדה הבהיר של הדם המלא, WBCs אינם נראים בין כדוריות הדם האדומות.(איור 1)

איור 1 תמונה שדה בהיר של דם מלא.

2. תמונת פלואורסצנציה של דם מלא

צבעי AO ו-PI הם שניהם מכתים DNA בגרעין התא של התאים.לכן, טסיות דם, כדוריות דם אדומות או פסולת תאים אינם מסוגלים להשפיע על ריכוז הלויקוציטים ועל תוצאת הכדאיות.לויקוציטים חיים (ירוק) ולויקוציטים מתים (אדומים) ניתנים להדמיה בקלות בתמונות הקרינה.(איור 2)

איור 2 איור 2 תמונות פלואורסצנטי של דם מלא.(א).תמונה של ערוץ AO;(ב) תמונה של ערוץ PI;(ג) מיזוג תמונות של ערוץ AO ו-PI.

3. ריכוז וכדאיות של לויקוציטים

תוכנת Countstar FL סופרת אוטומטית תאים של שלושה מקטעי תא ומחשבת את הערך הממוצע של ספירת תאי WBC הכוללת (1202), ריכוז (1.83 x 106 תאים/מ"ל) ואחוז כדאיות (82.04%).ניתן לייצא בקלות את התמונות והנתונים של הדם המלא כ-PDF, תמונה או Excel לניתוח נוסף או לארכיון נתונים.

איור 3 צילום מסך של תוכנת Countstar Rigel