末梢血単核細胞（PBMC）は、密度勾配遠心分離によって全血から分離するように処理されることがよくあります。これらの細胞は、リンパ球（T細胞、B細胞、NK細胞）と単球で構成されており、免疫学、細胞治療、感染症、ワクチン開発の分野で一般的に使用されています。PBMCの生存率と濃度を監視および分析することは、臨床検査室、基礎医学研究、および免疫細胞生産にとって非常に重要です。
図1.密度勾配遠心分離による新鮮な血液から分離されたPBMC
AOPIデュアル蛍光カウントは、細胞濃度と生存率を検出するために使用されるアッセイタイプです。解決策は、アクリジンオレンジ（緑色蛍光核酸染色）とヨウ化プロピジウム（赤色蛍光核酸染色）の組み合わせです。ヨウ化プロピジウム（PI）は、膜が損傷した細胞にのみ入る膜排除色素ですが、アクリジンオレンジは集団内のすべての細胞に浸透することができます。両方の色素が核内に存在する場合、ヨウ化プロピジウムは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によってアクリジンオレンジの蛍光を減少させます。その結果、無傷の膜を持つ有核細胞は蛍光緑色に染色され、生きているものとしてカウントされますが、膜が損傷した有核細胞は蛍光赤色のみを染色し、 システムを使用すると死んだものとしてカウントされます。赤血球、血小板、破片などの非核物質は蛍光を発せず、 ソフトウェアによって無視されます。
実験手順：
1.PBMCサンプルをPBSで5つの異なる濃度に希釈します。
2. 12µlのAO / PI溶液を12µlのサンプルに加え、ピペットで穏やかに混合します。
3. 20µlの混合物をチャンバースライドに引き込みます。
4.細胞をチャンバー内に約1分間静置させます。
5.スライドをCountstar機器に挿入します。
6.「AO/PI生存率」アッセイを選択し、 Countstarでテストします。
注意：AOとPIは発がん性の可能性があります。皮膚や目に直接触れないように、オペレーターは個人用保護具（PPE）を着用することをお勧めします。
結果：
1.PBMCの明視野および蛍光画像
AOとPI色素は、どちらも細胞の細胞核のDNAを染色します。したがって、血小板、赤血球、または細胞破片は、PBMCの濃度と生存率の結果に影響を与えることができません。生細胞、死細胞、破片は、 FLによって生成された画像に基づいて簡単に区別できます（図1）。
図2．PBMCの明視野および蛍光画像
2.PBMCの濃度と生存率
PBMCサンプルをPBSで2、4、8、16倍に希釈した後、これらのサンプルをAO / PI色素混合物とインキュベートし、 でそれぞれ分析しました。PBMCの濃縮と生存率の結果を以下の図に示します。
