პერიფერიული სისხლის მონონუკლეარული უჯრედები (PBMCs) ხშირად მუშავდება მთლიანი სისხლისგან გამოსაყოფად სიმკვრივის გრადიენტური ცენტრიფუგაციით.ეს უჯრედები შედგება ლიმფოციტებისგან (T უჯრედები, B უჯრედები, NK უჯრედები) და მონოციტები, რომლებიც ჩვეულებრივ გამოიყენება იმუნოლოგიის, უჯრედული თერაპიის, ინფექციური დაავადებების და ვაქცინის შემუშავების სფეროში.PBMC-ის სიცოცხლისუნარიანობისა და კონცენტრაციის მონიტორინგი და ანალიზი გადამწყვეტია კლინიკური ლაბორატორიებისთვის, ძირითადი სამედიცინო მეცნიერების კვლევებისთვის და იმუნური უჯრედების წარმოებისთვის.
ნახ 1. იზოლირებული PBMC სუფთა სისხლიდან სიმკვრივის გრადიენტური ცენტრიფუგაციით
AOPI ორმაგი ფლუორესცის დათვლა არის ანალიზის ტიპი, რომელიც გამოიყენება უჯრედის კონცენტრაციისა და სიცოცხლისუნარიანობის გამოსავლენად.ხსნარი არის აკრიდინის ფორთოხლის (მწვანე-ფლუორესცენტული ნუკლეინის მჟავის ლაქა) და პროპიდიუმის იოდიდის (წითელ-ფლუორესცენტული ნუკლეინის მჟავას ლაქა) კომბინაცია.პროპიდიუმის იოდიდი (PI) არის მემბრანის გამომრიცხავი საღებავი, რომელიც ხვდება მხოლოდ დაზიანებული მემბრანის უჯრედებში, ხოლო აკრიდინის ფორთოხალს შეუძლია შეაღწიოს პოპულაციის ყველა უჯრედში.როდესაც ორივე საღებავი იმყოფება ბირთვში, პროპიდიუმის იოდიდი იწვევს აკრიდინის ფორთოხლის ფლუორესცენტის შემცირებას ფლუორესცენტული რეზონანსული ენერგიის გადაცემით (FRET).შედეგად, უცვლელი მემბრანების ბირთვიანი უჯრედები ღებულობენ ფლუორესცენტულ მწვანეს და ითვლება ცოცხალად, ხოლო ბირთვული უჯრედები დაზიანებული მემბრანებით მხოლოდ ფლუორესცენტულ წითლად შეღებავს და ითვლება მკვდრად Countstar® FL სისტემის გამოყენებისას.არაბირთვიანი მასალა, როგორიცაა სისხლის წითელი უჯრედები, თრომბოციტები და ნამსხვრევები, არ ფლუორესცირდება და იგნორირებულია Countstar® FL პროგრამული უზრუნველყოფის მიერ.
ექსპერიმენტული პროცედურა:
1. PBMC ნიმუში განზავდეს 5 სხვადასხვა კონცენტრაციაში PBS-ით;
2. დაამატეთ 12µl AO/PI ხსნარი 12µl ნიმუშში, ნაზად შერეული პიპეტით;
3. გადაიტანეთ 20µl ნარევი კამერის სლაიდში;
4. მიეცით უჯრედები კამერაში დაახლოებით 1 წუთის განმავლობაში;
5. ჩასვით სლაიდი Countstar FL ინსტრუმენტში;
6. აირჩიეთ „AO/PI სიცოცხლისუნარიანობა“ ანალიზი, შემდეგ შეამოწმეთ Countstar FL-ის მიერ.
სიფრთხილე: AO და PI არის პოტენციური კანცეროგენი.რეკომენდირებულია ოპერატორმა ატაროს პერსონალური დამცავი მოწყობილობა (PPE) კანთან და თვალებთან უშუალო კონტაქტის თავიდან ასაცილებლად.
შედეგი:
1. PBMC-ის ნათელი ველის და ფლუორესცენციის გამოსახულებები
AO და PI საღებავი ორივე დნმ-ის ლაქებია უჯრედის ბირთვში.ამიტომ, თრომბოციტები, სისხლის წითელი უჯრედები ან უჯრედული ნარჩენები ვერ ახდენენ გავლენას PBMC-ების კონცენტრაციაზე და სიცოცხლისუნარიანობაზე.ცოცხალი უჯრედები, მკვდარი უჯრედები და ნამსხვრევები ადვილად შეიძლება გამოირჩეოდეს Countstar FL-ის მიერ წარმოქმნილი სურათების საფუძველზე (სურათი 1).
სურათი 2. PBMC-ის ნათელი ველის და ფლუორესცენციის გამოსახულებები
2. PBMC-ის კონცენტრაცია და სიცოცხლისუნარიანობა
PBMC ნიმუშები განზავებული იყო 2, 4, 8 და 16-ჯერ PBS-ით, შემდეგ ეს ნიმუშები ინკუბირებული იყო AO/PI საღებავის ნარევით და გაანალიზდა Countstar FL-ით შესაბამისად.PBMC-ის კონცენტრაციისა და სიცოცხლისუნარიანობის შედეგი ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში:
