AO PI 이중 형광 PBMC의 농도 및 생존력 분석

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 종종 밀도 구배 원심분리에 의해 전혈에서 분리되도록 처리됩니다.이러한 세포는 면역학, 세포치료제, 감염병 및 백신 개발 분야에서 일반적으로 사용되는 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포)와 단핵구로 구성됩니다.PBMC의 생존력과 농도를 모니터링하고 분석하는 것은 임상 실험실, 기초 의학 연구 및 면역 세포 생산에 매우 중요합니다.

그림 1. 밀도 구배 원심분리를 통해 신선한 혈액에서 분리된 PBMC

AOPI 이중 형광 계수는 세포 농도 및 생존력을 감지하는 데 사용되는 분석 유형입니다.용액은 acridine orange(녹색 형광 핵산 염색)와 propidium iodide(적색 형광 핵산 염색)의 조합입니다.Propidium iodide(PI)는 손상된 막이 있는 세포에만 들어가는 막 배제 염료인 반면, acridine 오렌지는 집단의 모든 세포에 침투할 수 있습니다.두 염료가 핵에 존재할 때 요오드화 프로피듐은 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 아크리딘 오렌지 형광을 감소시킵니다.결과적으로 막이 손상되지 않은 유핵 세포는 형광 녹색으로 염색되어 살아있는 것으로 간주되는 반면 손상된 막이 있는 유핵 세포는 형광 적색으로만 염색되며 ® FL 시스템을 사용할 때 죽은 것으로 간주됩니다.적혈구, 혈소판 및 파편과 같은 핵이 없는 물질은 형광을 내지 않으며 ® FL 소프트웨어에서 무시됩니다.

실험적 절차:

1. PBMC 샘플을 PBS로 5가지 농도로 희석합니다.
2. 12µl AO/PI 용액을 12µl 샘플에 추가하고 피펫으로 부드럽게 혼합합니다.
3. 20µl 혼합물을 챔버 슬라이드에 넣습니다.
4. 세포가 약 1분 동안 챔버에 정착되도록 합니다.
5. 슬라이드를 Countstar FL 기기에 삽입합니다.
6. "AO/PI Viability" 분석을 선택한 다음 Countstar FL로 테스트합니다.

주의: AO와 PI는 잠재적인 발암 물질입니다.작업자가 피부와 눈에 직접 닿지 않도록 개인 보호 장비(PPE)를 착용하는 것이 좋습니다.

결과:

1.PBMC의 명시야 및 형광 이미지

AO 및 PI 염료는 모두 세포의 세포 핵에 있는 염색 DNA입니다.따라서 혈소판, 적혈구 또는 세포 파편은 PBMC 농도 및 생존 결과에 영향을 줄 수 없습니다.살아있는 세포, 죽은 세포 및 파편은 FL에서 생성된 이미지를 기반으로 쉽게 구별할 수 있습니다(그림 1).