Перифериялык кан мононуклеардык клеткалары (PBMCs) көп учурда тыгыздык градиентти центрифугалоо жолу менен бүт кандан бөлүү үчүн иштетилет.Бул клеткалар лимфоциттерден (Т-клеткалар, В-клеткалар, NK клеткалары) жана моноциттерден турат, көбүнчө иммунология, клетка терапиясы, жугуштуу оорулар жана вакцинаны иштеп чыгуу тармагында колдонулат.Мониторинг жана PBMC жашоо жөндөмдүүлүгүн жана концентрациясын талдоо клиникалык лабораториялар, негизги медициналык илим изилдөө жана иммундук клетка өндүрүү үчүн абдан маанилүү болуп саналат.
Fig 1. Тыгыздык градиент центрифугасы менен жаңы кандан бөлүнгөн PBMC
AOPI Dual-fluoresces эсептөө клетка концентрациясын жана жашоого жөндөмдүүлүгүн аныктоо үчүн колдонулган анализ түрү болуп саналат.Эритме акридин кызгылт сары (жашыл-флуоресценттик нуклеин кислотасынын боеги) жана пропидий йодидинин (кызыл-флуоресценттик нуклеин кислотасынын боеги) айкалышы.Propidium йодид (PI) акридин апельсин популяциянын бардык клеткаларына кире алат, ал эми кабыкчалары бузулган клеткаларга гана кирүүчү мембрананы жокко чыгаруучу боёк.Эки боёк тең ядродо болгондо, пропидий йодид флуоресценттик резонанстык энергиянын (FRET) өтүшү менен акридин кызгылт сары флуоресценциянын азайышын шарттайт.Натыйжада, кабыкчалары бузулбаган ядролуу клеткалар флуоресценттик жашыл түскө боёп, тирүү деп эсептелет, ал эми мембранасы бузулган ядролуу клеткалар флуоресценттик кызыл түскө гана боёйт жана Countstar® FL тутумун колдонууда өлүк деп эсептелет.Эритроциттер, тромбоциттер жана калдыктар сыяктуу ядросуз материал флуоресценттенбейт жана Countstar® FL программасы тарабынан этибарга алынбайт.
Эксперименттик процедура:
1.Dilute PBMC үлгүсүн PBS менен 5 түрдүү концентрациясына;
2. 12μl AO/PI эритмесин пипетка менен акырын аралаштырган 12µl үлгүгө кошуңуз;
3.20мкл аралашманы камеранын слайдына тартыңыз;
4.Клеткаларды камерага 1 мүнөткө жакын жайгаштырууга уруксат бериңиз;
Countstar FL инструментине слайдды 5.Insect;
6. "AO/PI Viability" анализин тандап, андан кийин Countstar FL тарабынан сынап көрүңүз.
Абайлаңыз: AO жана PI потенциалдуу канцероген болуп саналат.Оператордун териге жана көзгө түздөн-түз тийбеш үчүн жеке коргонуу шаймандарын (ЖПБ) кийүү сунушталат.
Натыйжа:
PBMC 1.Bright Field жана Fluorescence сүрөттөрү
AO жана PI боёгу экөө тең клеткалардын клетка ядросунда ДНКны боёйт.Ошондуктан, тромбоциттер, кызыл кан клеткалары же уюлдук калдыктар PBMCs концентрациясына жана жашоо жөндөмдүүлүгүнө таасир эте албайт.Тирүү клеткаларды, өлүк клеткаларды жана калдыктарды Countstar FL тарабынан түзүлгөн сүрөттөрдүн негизинде оңой айырмалоого болот (1-сүрөт).
2-сүрөт. PBMCдин жаркыраган талаа жана флуоресценттик сүрөттөрү
2.ПБМКнын концентрациясы жана жашоого жөндөмдүүлүгү
PBMC үлгүлөрү PBS менен 2, 4, 8 жана 16 жолу суюлтулган, андан кийин ал үлгүлөр AO/PI боёк аралашмасы менен инкубацияланган жана Countstar FL тарабынан талданган.ПБМКнын концентрациясынын жана жашоого жөндөмдүүлүгүнүн натыйжасы төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөн:
