Periphere Blutt mononuklear Zellen (PBMCs) ginn dacks veraarbecht fir vu ganz Blutt duerch Dichtgradient Zentrifugatioun ze trennen.Dës Zelle besteet aus Lymphozyten (T Zellen, B Zellen, NK Zellen) a Monocyten, allgemeng benotzt am Feld vun der Immunologie, Zelltherapie, Infektiounskrankheeten an Impfungentwécklung.Iwwerwaachung an Analyse vun der Viabilitéit an der Konzentratioun vu PBMC ass entscheedend fir klinesch Laboratoiren, Basis medizinesch Wëssenschaftsfuerschung an Immunzellproduktioun.
Lalumi 1. Isoléiert PBMC vu frësche Blutt mat Dichtgradient Zentrifugatioun
AOPI Dual-Fluoreszenzzielung ass den Assay-Typ deen benotzt gëtt fir Zellkonzentratioun a Viabilitéit z'entdecken.D'Léisung ass eng Kombinatioun vun Acridin orange (de gréng-fluoreszent Nukleinsäure Fleck) a Propidium Jodid (de roude-fluoreszent Nukleinsäure Fleck).Propidium Jodid (PI) ass e Membran Ausgrenzungsfaarf deen nëmmen Zellen mat kompromittéierte Membranen erakënnt, während Acridin orange fäeg ass all Zellen an enger Bevëlkerung ze penetréieren.Wa béid Faarfstoffer am Kär präsent sinn, verursaacht Propidiumjodid eng Reduktioun vun der Acridin orange Fluoreszenz duerch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfert (FRET).Als Resultat, nukleéiert Zellen mat intakte Membranen fluoreszent gréng a ginn als lieweg gezielt, wärend nukleéiert Zellen mat kompromittéierte Membranen nëmmen fluoreszent rout flecken an als dout gezielt ginn wann Dir de Countstar® FL System benotzt.Net-nukleéiert Material wéi rout Bluttzellen, Plättchen a Schutt fluoreszen net a ginn vun der Countstar® FL Software ignoréiert.
Experimentell Prozedur:
1.Dilute d'PBMC Probe an 5 verschidde Konzentratioune mat PBS;
2.Add 12μl AO / PI Léisung an 12μl Probe, sanft mat Pipette gemëscht;
3.Zeechnen 20µl Mëschung an d'Kammer Rutsch;
4.Allow d'Zellen sech an der Chamber fir ongeféier 1 Minutt ze settelen;
5.Insect de Rutsch an Countstar FL Instrument;
6.Choose der "AO / PI Viability" assay, dann Test vun Countstar FL.
Opgepasst: AO a PI ass e potenziell Karzinogen.Et ass recommandéiert datt de Bedreiwer perséinleche Schutzausrüstung (PPE) droen fir direkten Kontakt mat Haut an Aen ze vermeiden.
Resultat:
1.Bright Field a Fluoreszenz Biller vun der PBMC
Den AO a PI Faarf si béid Flecken DNA am Zellkär vun Zellen.Dofir, Plättchen, rout Bluttzellen, oder cellulär Schutt sinn net fäeg d'PBMCs Konzentratioun a Viabilitéitsresultat ze beaflossen.Lieweg Zellen, dout Zellen an Dreck kënnen einfach ënnerscheeden Basis op de Biller generéiert vun Countstar FL (Dorënner 1).
Figur 2. Bright Field a Fluoreszenz Biller vun der PBMC
2.Konzentratioun a Viabilitéit vun PBMC
D'PBMC Echantillon waren an 2, 4, 8 an 16 Mol mat PBS verdënntem, dann goufen déi Echantillon mat engem AO /PI Faarf Mëschung incubated an analyséiert vun Countstar FL respektiv.D'Resultat vun der Konzentratioun a Viabilitéit vu PBMC gëtt gewisen wéi ënnendrënner Figur:
