ຈຸລັງ mononuclear ເລືອດ peripheral (PBMCs) ມັກຈະຖືກປຸງແຕ່ງເພື່ອແຍກອອກຈາກເລືອດທັງຫມົດໂດຍການ centrifugation gradient ຄວາມຫນາແຫນ້ນ.ຈຸລັງເຫຼົ່ານັ້ນປະກອບດ້ວຍ lymphocytes (T cells, B cell, NK cells) ແລະ monocytes, ຖືກນໍາໃຊ້ທົ່ວໄປໃນດ້ານພູມຕ້ານທານ, ການປິ່ນປົວດ້ວຍຈຸລັງ, ພະຍາດຕິດຕໍ່ແລະການພັດທະນາວັກຊີນ.ການຕິດຕາມແລະການວິເຄາະຄວາມເປັນໄປໄດ້ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ PBMC ແມ່ນສໍາຄັນສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງທາງດ້ານການຊ່ວຍ, ການຄົ້ນຄວ້າວິທະຍາສາດການແພດຂັ້ນພື້ນຖານແລະການຜະລິດຈຸລັງພູມຕ້ານທານ.
Fig 1. Isolated PBMC ຈາກເລືອດສົດດ້ວຍການ centrifugation gradient ຄວາມຫນາແຫນ້ນ
ການນັບ AOPI Dual-fluoresces ແມ່ນປະເພດການວິເຄາະທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການກວດສອບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເຊນແລະຄວາມເປັນໄປໄດ້.ການແກ້ໄຂແມ່ນການປະສົມປະສານຂອງສີສົ້ມ acridine (ຮອຍເປື້ອນອາຊິດ nucleic ສີຂຽວ-fluorescent) ແລະ propidium iodide (ຮອຍເປື້ອນອາຊິດ nucleic ສີແດງ fluorescent).Propidium iodide (PI) ແມ່ນສີຍ້ອມການຍົກເວັ້ນເຍື່ອທີ່ພຽງແຕ່ເຂົ້າໄປໃນຈຸລັງທີ່ມີເຍື່ອທີ່ຖືກທໍາລາຍ, ໃນຂະນະທີ່ສີສົ້ມ acridine ສາມາດເຂົ້າໄປໃນຈຸລັງທັງຫມົດໃນປະຊາກອນ.ເມື່ອສີຍ້ອມທັງສອງມີຢູ່ໃນນິວເຄລຍ, propidium iodide ເຮັດໃຫ້ເກີດການຫຼຸດລົງຂອງ fluorescence ສີສົ້ມ acridine ໂດຍການໂອນພະລັງງານ fluorescence resonance (FRET).ດັ່ງນັ້ນ, ຈຸລັງ nucleated ທີ່ມີເຍື່ອ intact stain ສີຂຽວ fluorescent ແລະຖືກນັບວ່າເປັນຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດ, ໃນຂະນະທີ່ຈຸລັງ nucleated ທີ່ມີເຍື່ອປະນີປະນອມພຽງແຕ່ stain ສີແດງ fluorescent ແລະຖືກນັບວ່າເປັນຕາຍໃນເວລາທີ່ການນໍາໃຊ້ລະບົບ Countstar® FL.ວັດສະດຸທີ່ບໍ່ມີທາດນິວເຄລຍ ເຊັ່ນ: ເມັດເລືອດແດງ, ເມັດເລືອດ ແລະສິ່ງເສດເຫຼືອທີ່ບໍ່ເປັນທາດ fluoresce ແລະຖືກລະເລີຍໂດຍຊອບແວ Countstar® FL.
ຂັ້ນຕອນການທົດລອງ:
1.ເຈືອຈາງຕົວຢ່າງ PBMC ເຂົ້າໄປໃນ 5 ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນກັບ PBS;
2.ຕື່ມ 12µl AO/PI solution ເຂົ້າໄປໃນຕົວຢ່າງ 12µl, ຄ່ອຍໆປະສົມກັບ pipette;
3.ແຕ້ມສ່ວນປະສົມ 20µl ເຂົ້າໄປໃນສະໄລ້ຫ້ອງ;
4.ອະນຸຍາດໃຫ້ຈຸລັງຕັ້ງຖິ່ນຖານໃນສະພາສໍາລັບການປະມານ 1 ນາທີ;
5.Insect ເລື່ອນເຂົ້າໄປໃນ Countstar FL ເຄື່ອງມື;
6.ເລືອກ "AO/PI Viability" assay, ຈາກນັ້ນທົດສອບໂດຍ Countstar FL.
ຂໍ້ຄວນລະວັງ: AO ແລະ PI ແມ່ນສານກໍ່ມະເຮັງທີ່ອາດຈະເກີດຂຶ້ນ.ແນະນໍາໃຫ້ຜູ້ປະຕິບັດການໃສ່ອຸປະກອນປ້ອງກັນສ່ວນບຸກຄົນ (PPE) ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການຕິດຕໍ່ໂດຍກົງກັບຜິວຫນັງແລະຕາ.
ຜົນໄດ້ຮັບ:
1.ພາບ Field ແລະ Fluorescence ຂອງ PBMC
ສີຍ້ອມ AO ແລະ PI ແມ່ນທັງສອງ stains DNA ໃນ nucleus ຂອງຈຸລັງ.ດັ່ງນັ້ນ, Platelets, ເມັດເລືອດແດງ, ຫຼືສິ່ງເສດເຫຼືອຂອງຈຸລັງບໍ່ສາມາດສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ PBMCs ແລະຜົນໄດ້ຮັບທີ່ມີຊີວິດຊີວາ.ຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດ, ຈຸລັງຕາຍແລະສິ່ງເສດເຫຼືອສາມາດຈໍາແນກໄດ້ງ່າຍໂດຍອີງໃສ່ຮູບພາບທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ Countstar FL (ຮູບ 1).
ຮູບທີ 2.ພາບທົ່ງນາສົດໃສ ແລະ ດອກໄຟຂອງ PBMC
2.Concentration and Viability of PBMC
ຕົວຢ່າງ PBMC ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງໃນ 2, 4, 8 ແລະ 16 ເທື່ອດ້ວຍ PBS, ຫຼັງຈາກນັ້ນຕົວຢ່າງເຫຼົ່ານັ້ນໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍສານປະສົມສີຍ້ອມ AO / PI ແລະວິເຄາະໂດຍ Countstar FL ຕາມລໍາດັບ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແລະຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ PBMC ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນດັ່ງລຸ່ມນີ້:
