Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PBMC) dažnai apdorojamos, kad būtų atskirtos nuo viso kraujo centrifuguojant tankio gradientu.Šios ląstelės susideda iš limfocitų (T ląstelių, B ląstelių, NK ląstelių) ir monocitų, dažniausiai naudojamų imunologijos, ląstelių terapijos, infekcinių ligų ir vakcinų kūrimo srityse.PBMC gyvybingumo ir koncentracijos stebėjimas ir analizė yra labai svarbūs klinikinėms laboratorijoms, pagrindinių medicinos mokslų tyrimams ir imuninių ląstelių gamybai.
1 pav. Išskirtas PBMC iš šviežio kraujo naudojant tankio gradiento centrifugavimą
AOPI dvigubo fluorescavimo skaičiavimas yra tyrimo tipas, naudojamas ląstelių koncentracijai ir gyvybingumui nustatyti.Tirpalas yra akridino oranžinės spalvos (žaliai fluorescencinės nukleino rūgšties dėmės) ir propidžio jodido (raudonai fluorescencinės nukleorūgšties dėmės) derinys.Propidžio jodidas (PI) yra membraną išskiriantys dažai, kurie patenka tik į ląsteles, kurių membranos pažeistos, o akridino apelsinas gali prasiskverbti į visas populiacijos ląsteles.Kai branduolyje yra abiejų dažiklių, propidžio jodidas sumažina akridino oranžinės spalvos fluorescenciją dėl fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo (FRET).Dėl to branduolinės ląstelės su nepažeistomis membranomis nusidažo fluorescuojančia žalia spalva ir yra skaičiuojamos kaip gyvos, o branduolinės ląstelės su pažeistomis membranomis nusidažo tik fluorescuojančia raudona spalva ir, naudojant Countstar® FL sistemą, skaičiuojamos kaip negyvos.Nebranduolinės medžiagos, tokios kaip raudonieji kraujo kūneliai, trombocitai ir šiukšlės, nefluorescuoja ir Countstar® FL programinė įranga nepaiso.
Eksperimentinė procedūra:
1.PBMC mėginį atskieskite iki 5 skirtingų koncentracijų PBS;
2. Į 12 µl mėginio įpilkite 12 µl AO/PI tirpalo, švelniai sumaišę pipete;
3. Įtraukite 20 µl mišinio į kameros stiklelį;
4. Leiskite ląstelėms nusistovėti kameroje maždaug 1 minutę;
5. Įdėkite stiklelį į Countstar FL instrumentą;
6. Pasirinkite „AO/PI gyvybingumo“ testą, tada patikrinkite Countstar FL.
Atsargiai: AO ir PI yra potencialūs kancerogenai.Norint išvengti tiesioginio kontakto su oda ir akimis, operatoriui rekomenduojama dėvėti asmenines apsaugos priemones (AAP).
Rezultatas:
1. PBMC šviesaus lauko ir fluorescencijos vaizdai
AO ir PI dažai nudažo DNR ląstelių branduolyje.Todėl trombocitai, raudonieji kraujo kūneliai ar ląstelių liekanos negali paveikti PBMC koncentracijos ir gyvybingumo rezultato.Gyvas ląsteles, negyvas ląsteles ir šiukšles galima lengvai atskirti pagal Countstar FL sukurtus vaizdus (1 pav.).
2 pav. PBMC šviesaus lauko ir fluorescencijos vaizdai
2. PBMC koncentracija ir gyvybingumas
PBMC mėginiai buvo praskiesti 2, 4, 8 ir 16 kartų su PBS, tada tie mėginiai buvo inkubuojami su AO / PI dažų mišiniu ir atitinkamai analizuojami Countstar FL.PBMC koncentracijos ir gyvybingumo rezultatas parodytas toliau pateiktame paveikslėlyje:
