Leukocitų analizė visame kraujyje yra įprastas tyrimas klinikinėje laboratorijoje arba kraujo banke.Leukocitų koncentracija ir gyvybingumas yra gyvybiškai svarbus kraujo saugojimo kokybės kontrolės rodiklis.Visame kraujyje, be leukocitų, yra daug trombocitų, raudonųjų kraujo kūnelių arba ląstelių nuolaužų, dėl kurių neįmanoma analizuoti viso kraujo tiesiai po mikroskopu arba šviesaus lauko ląstelių skaitikliu.Įprasti baltųjų kraujo kūnelių skaičiavimo metodai apima eritrocitų lizės procesą, kuris užima daug laiko.
AOPI dvigubo fluorescavimo skaičiavimas yra tyrimo tipas, naudojamas ląstelių koncentracijai ir gyvybingumui nustatyti.Tirpalas yra akridino oranžinės spalvos (žaliai fluorescencinės nukleino rūgšties dėmės) ir propidžio jodido (raudonai fluorescencinės nukleorūgšties dėmės) derinys.Propidžio jodidas (PI) yra membraną išskiriantys dažai, kurie patenka tik į ląsteles, kurių membranos pažeistos, o akridino apelsinas gali prasiskverbti į visas populiacijos ląsteles.Kai branduolyje yra abiejų dažiklių, propidžio jodidas sumažina akridino oranžinės spalvos fluorescenciją dėl fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo (FRET).Dėl to branduolinės ląstelės su nepažeistomis membranomis nusidažo fluorescuojančia žalia spalva ir yra skaičiuojamos kaip gyvos, o branduolinės ląstelės su pažeistomis membranomis nusidažo tik fluorescuojančia raudona spalva ir, naudojant Countstar® Rigel sistemą, skaičiuojamos kaip negyvos.
Countstar Rigel yra idealus sprendimas daugeliui sudėtingų ląstelių populiacijos apibūdinimo tyrimų, leidžiančių greitai analizuoti baltuosius kraujo kūnelius visame kraujyje.
Eksperimentinė procedūra:
1. Paimkite 20 µl kraujo mėginio ir praskieskite mėginį 180 µl PBS.
2. Į 12 µl mėginio įpilkite 12 µl AO/PI tirpalo, švelniai sumaišę pipete;
3. Įtraukite 20 µl mišinio į kameros stiklelį;
4. Leiskite ląstelėms nusistovėti kameroje maždaug 1 minutę;
5. Įdėkite stiklelį į Countstar FL instrumentą;
6. Pasirinkite „AO/PI Viability“ tyrimą, tada įveskite šio mėginio mėginio ID.
7. Pasirinkite skiedimo santykį, ląstelių tipą, spustelėkite „Vykdyti“, kad pradėtumėte testą.
Atsargiai: AO ir PI yra potencialūs kancerogenai.Norint išvengti tiesioginio kontakto su oda ir akimis, operatoriui rekomenduojama dėvėti asmenines apsaugos priemones (AAP).
Rezultatas:
1. Ryškus laukas Viso kraujo vaizdas
Ryškiame viso kraujo vaizde WBC tarp raudonųjų kraujo kūnelių nematyti.(Figūra 1)
1 pav. Ryškaus lauko viso kraujo vaizdas.
2. Fluorescencinis viso kraujo vaizdas
AO ir PI dažai nudažo DNR ląstelių branduolyje.Todėl trombocitai, raudonieji kraujo kūneliai ar ląstelių liekanos negali paveikti leukocitų koncentracijos ir gyvybingumo rezultato.Gyvi leukocitai (žalia) ir negyvi leukocitai (raudoni) lengvai matomi fluorescenciniuose vaizduose.(2 pav.)
2 pav. Viso kraujo fluorescenciniai vaizdai.(A).AO kanalo vaizdas;(B) PI kanalo vaizdas;(C) Sujunkite AO ir PI kanalo vaizdus.
3. Leukocitų koncentracija ir gyvybingumas
Programinė įranga Countstar FL automatiškai skaičiuoja trijų kamerų sekcijų ląsteles ir apskaičiuoja vidutinę bendro WBC ląstelių skaičiaus (1202), koncentracijos (1,83 x 106 ląstelės/ml) ir gyvybingumo procento (82,04%) vertę.Viso kraujo vaizdai ir duomenys gali būti lengvai eksportuojami kaip PDF, vaizdas arba Excel, kad būtų galima papildomai analizuoti ar archyvuoti duomenis.
3 pav. „Countstar Rigel Software“ ekrano kopija
